[發明專利]一種斜帶石斑魚抗菌肽的原核表達產物及其制備方法

有效

• 申請號: 201110386427.6
• 申請日: 2011-11-28
• 公開（公告）號: CN102433341A
• 公開（公告）日: 2012-05-02
• 發明（設計）人: 王克堅;曲海東;陳貝
• 申請（專利權）人: 廈門大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/70;C12N1/21;C07K14/46;C07K1/22
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所 35200
• 代理人: 馬應森

技術領域

本發明涉及生物技術領域中的魚類基因工程表達，尤其是涉及一種斜帶石斑魚抗菌肽Hepcidin3的表達載體和表達產物及其構建制備方法。

背景技術

抗菌肽(Antimicrobial?peptides，AMPs)是魚類先天免疫系統的重要組成成分，魚類可分泌產生多種抗菌肽來抵抗水生環境中大量的病原微生物的侵襲，這些病原微生物包括多種細菌、真菌和病毒等等。利用分子生物學技術，在體外獲得大量的、有活性的抗菌肽產品，進一步應用這些抗菌肽產品可能增強水產動物的免疫力，提高養殖產量，并對解決海水養殖中面臨的由于長期濫用抗生素而引起的細菌耐藥性、水產品藥物殘留和水環境污染等問題具有重要的科學、現實和經濟意義。

斜帶石斑魚(Epinephelus?coioides，orange-spotted?grouper)俗稱青斑，是暖水性中下層魚類，主要分布于印度洋、紅海、地中海、北太平洋西部和東南亞地區。其肉質鮮美、營養豐富、抗逆性強、生長快、體色艷麗，市場價格高且穩定，目前斜帶石斑魚已成為世界上育苗量和人工養殖產量最高的石斑魚類，也是我國福建、廣東、海南、臺灣四省重要的海水養殖魚類之一。但是近年來，由于致病性微生物引起的魚病爆發，使得斜帶石斑魚養殖業承受著巨大的經濟損失(1.林建輝.斜帶石斑魚的生物學特性及養殖技術[J].齊魯漁業，2008，25(2)：22-23；2.黃瑞芳.斜帶石斑魚溶藻弧菌病的研究[J].水產科學，2005，24(6)：1-3；3.梅冰，周永燦，徐先棟，王世峰，謝珍玉.斜帶石斑魚爛尾病病原菌的分離與鑒定[J].熱帶海洋學報，2010，29(6)：118-124)。

本申請人在前期研究中從青石斑魚(Epinephelus?awoara)中克隆獲得了1個成熟肽具有4個半胱氨酸殘基的hepcidin基因，繼而從福建漳浦的養殖斜帶石斑魚中克隆得到了另1個新的成熟肽含有4個半胱氨酸殘基的hepcidin基因，與已報道的另外2個在斜帶石斑魚中發現的hepcidin基因EC-hepcidin1和EC-hepcidin2具有同源性，推測是其變體，故命名為EC-hepcidin3。已發現人工合成的EC-hepcidin1和EC-hepcidin2的成熟肽具有抗菌、抗病毒的作用(4.Jing-Geng?Zhou，Jing-Guang?Wei，Dan?Xu，Hua-Chun?Cui，Yang?Yan，Zheng-Liang?Ou-Yang，Xiao-Hong?Huang，You-Hua?Huang，Qi-Wei?Qin.Molecular?cloning?and?characterization?of?two?novel?hepcidins?from?orange-spotted?grouper，Epinephelus?coioides[J].Fish&Shellfish?Immunology，2011，30：559-568)。

同其他已發現的魚類hepcidin結構一樣，EC-hepcidin3包括內質網靶向的位于N端的信號肽，前導肽和位于C端的成熟肽，其中前導肽和成熟肽共同構成前體肽(propeptide?of?EC-hepcidin3，EC-proHep3)。

發明內容

本發明的目的旨在提供一種斜帶石斑魚抗菌肽的原核表達產物及其制備方法。

本發明構建的一種含有EC-hepcidin3基因的表達載體可在大腸桿菌中誘導表達，并通過高效純化表達產物而在體外獲得大量的表達產品。所述含有EC-hepcidin3基因的表達載體，是在原核表達載體pET-28a⁺中插入EC-hepcidin3前體肽基因序列所構成的重組表達載體pET28a/EC-hepcidin3。

本發明所述在體外獲得的表達產物，是重組表達載體pET28a/EC-hepcidin3在大腸桿菌中經誘導表達以及純化后獲得的重組蛋白EC-proHep3。

所述EC-hepcidin3前體肽的基因序列如序列表第1序列所示。

所述EC-hepcidin3前體肽的氨基酸序列如序列表第2序列所示。

所述重組蛋白EC-proHep3的制備方法包括以下步驟：

1)構建重組表達載體；

2)將步驟1)所得重組表達載體導入宿主細胞，獲得可表達EC-proHep3的基因工程菌菌株；

3)發酵培養已得到的基因工程菌菌株并進行誘導表達，獲得表達產物；

4)分離純化步驟3)所得的表達產物，獲得重組蛋白EC-proHep3。