[發明專利]一種評價微藻產油能力的方法

有效

• 申請號: 201110384755.2
• 申請日: 2011-11-28
• 公開（公告）號: CN102495151A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發明（設計）人: 元英進;陸姝歡;楊潔;牛艷紅
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

1.一種評價微藻產油能力的方法，其特征是包括如下步驟：

(1)微藻細胞收集及淬滅：

取出已培養好的藻液樣品3-5份，每份100-150mL，4℃下3000-5000rpm，離心3-4min，收集下層的細胞，用3-5mL代謝終止液，在-40℃下淬滅5-10分鐘，終止代謝反應，在-80℃下冷凍干燥4-6h獲得凍干細胞；

所述代謝終止液為含有1500mg·L^-1NaNO₃，36mg·L^-1CaCl₂·2H₂O，75mg·L^-1MgSO₄·7H₂O和40mg·L^-1K₂HPO₄·3H₂O的甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇和水的體積比為1∶2；

(2)提取細胞內脂肪酸：

從3-5份步驟(1)獲得的凍干細胞中各取15-25mg分別置于離心管中，每管加入0.75-1.5mL氯仿及0.3-0.6mL超純水，100rpm震蕩1h；再加入2-4mL脂肪提取液，室溫下以100rpm震蕩0.5h，收集氯仿相；向殘渣中加入2-4mL脂肪提取液，室溫下以100rpm震蕩0.5h，收集氯仿相；反復提取3次，將氯仿相合并，向其中加入0.5-1mL?1M?KCl水溶液，震蕩，3000-4000rpm，離心3-5min，棄水相，再加入1-2mL超純水，震蕩，3000-4000rpm，離心3-5min，棄水相，30-35℃真空干燥得干物質；

所述脂肪提取液為質量百分比為0.1％的二丁基羥基甲苯的氯仿甲醇溶液，所述氯仿甲醇溶液中氯仿的體積百分含量為66.7％；

(3)脂肪酸甲酯化：

將步驟(2)獲得的3-5份干物質分別溶于3-5份600-1000μL質量百分比為14％的三氟化硼-甲醇溶液中，加入10-20μg十七烷酸做為內標，分別置于15mL密封管內，在100℃水浴20-30min，溫度降至室溫，加入500-1000μl正己烷震蕩萃取30s，4000-5000rpm離心2min，得到正己烷相；取100-200μL正己烷相放入已編號的GC進樣瓶；

(4)GC-MS檢測

采用GC-MS對正己烷相中的脂肪酸甲酯進行定性和定量處理，條件如下：

色譜柱：DB-5氣相色譜柱，其規格為30m*0.25mm，0.25μm；

進樣量：1μL；

分流比：10∶1；

進樣口溫度：280℃；

GC?interface溫度：270℃；

氦氣流速：恒壓，91KPa；

升溫程序：70℃保持2min，以8℃·min^-1的速度升到290℃，并在290℃保持6min；

電離電壓：70eV；

源溫：250℃；

掃描范圍：50-800m/z；

掃描速度：2scan·s^-1；

從而獲得了脂肪酸甲酯混合物中的單個脂肪酸甲酯的含量；

(5)計算日產量

根據如下公式，計算藻類脂肪酸甲酯混合物的日產量：

P＝∑Wi/Day/CV

其中P是微藻脂肪酸甲酯日產量，Wi是步驟(4)中所得樣品中每個脂肪酸甲酯的重量，Day是步驟(1)所述從微藻接種到微藻收獲的時間長度，CV是步驟(1)所述收獲時微藻培養液的體積；

(6)十六烷值確定

根據如下公式計算藻類脂肪酸甲酯混合物的十六烷值：

SN＝∑(560×Pi)/MWi?????????????a

IN∑(254×D×Pi)/MWi????????????b

CN＝46.3+5458/SN-0.225×IN??????c

其中SN是皂化值；IN是碘值；CN是十六烷值；Pi是步驟(4)中所得樣品中每個脂肪酸甲酯的干重百分比，MWi是步驟(4)中所得樣品中每個脂肪酸甲酯的分子量，D是步驟(4)中所得樣品中每個脂肪酸甲酯的雙鍵數量。

2.根據權利要求1所述的一種評價微藻產油能力的方法，其特征是所述微藻為小球藻(Chlorella?sorokiniana)、柵藻(Scenedesmus?obliquus)、集胞藻(Synechocystis?sp.PCC6803)及魚腥藻(Anabaena?sp.PCC7120)。