[發(fā)明專利]一種淋巴道高轉(zhuǎn)移活性的胰腺癌細胞系

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110383666.6
• 申請日: 2011-11-26
• 公開（公告）號: CN103131667A
• 公開（公告）日: 2013-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 龍江;虞先濬;徐近;劉辰;張波;羅國培;劉亮;徐永峰;倪泉興
• 申請（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12Q1/02;C12R1/91
• 代理公司: 上海元一成知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬微生物動物細胞系領(lǐng)域，具體涉及一種具有淋巴道高轉(zhuǎn)移活性的胰腺癌細胞系。?

背景技術(shù)

胰腺癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤，據(jù)報道，近年來胰腺癌的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢。胰腺癌其生物學(xué)行為特殊，腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生早，手術(shù)切除率低，臨床治療效果不佳。臨床研究顯示，淋巴道轉(zhuǎn)移是胰腺癌主要的轉(zhuǎn)移方式，也是影響其預(yù)后的決定性因素，其特點表現(xiàn)為：①轉(zhuǎn)移發(fā)生早，即使是小于2cm的小胰癌，已有50％發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移；②轉(zhuǎn)移發(fā)生率高，胰頭癌淋巴轉(zhuǎn)移發(fā)生率高達71.2％；③影響預(yù)后的關(guān)鍵性因素，據(jù)有關(guān)統(tǒng)計，胰腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者5年生存率可達15％～40％，而轉(zhuǎn)移陽性的患者5年生存率僅為0％～7.7％；④淋巴轉(zhuǎn)移機制迄今不明，發(fā)生率與腫瘤大小、組織學(xué)類型等相關(guān)性尚不清楚。?

雖然，胰腺癌淋巴道轉(zhuǎn)移特性研究越來越受到重視，但目前國內(nèi)外尚未有理想的胰腺癌淋巴道轉(zhuǎn)移模型，胰腺癌淋巴轉(zhuǎn)移過程和機制的研究缺少良好的實驗平臺。目前，國內(nèi)崔宏等建立了不同轉(zhuǎn)移潛能的人胰腺癌JF305單克隆細胞亞系，研究了其裸小鼠原位移植瘤特性，但與淋巴轉(zhuǎn)移無明確相關(guān)；Kawano等用胰腺癌SUIT-4細胞分別注射于裸鼠的皮下和腹腔，出現(xiàn)局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，并進行相關(guān)調(diào)控研究，但尚沒有建立穩(wěn)定表型的轉(zhuǎn)移細胞系，其轉(zhuǎn)移潛能強弱、器官親和性及穩(wěn)定性等都不明確。?

目前，國內(nèi)外尚未見有關(guān)高淋巴轉(zhuǎn)移特性胰腺癌細胞系的報道。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目地是提供一種人胰腺癌細胞系，尤其是具有淋巴道高轉(zhuǎn)移活性的人胰腺癌細胞系。該細胞系能為深入研究胰腺癌淋巴轉(zhuǎn)移的機理，預(yù)防和治療胰腺癌淋巴轉(zhuǎn)移提供適宜的實驗平臺。?

本發(fā)明通過將人胰腺癌細胞株BxPC-3裸鼠爪墊皮下連續(xù)接種法建立淋巴道轉(zhuǎn)移模型；具體而言，本發(fā)明采用人胰腺癌BxPC-3細胞系(ATCC號：CRL1687，由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院提供)作為母細胞，通過裸鼠爪墊皮下連續(xù)接種法，在母系BxPC-3?細胞中分離不同轉(zhuǎn)移潛能的淋巴轉(zhuǎn)移瘤細胞亞系，通過體內(nèi)外實驗，篩選出淋巴道高轉(zhuǎn)移活性的胰腺癌細胞系(human?pancreatic?carcinoma?cell?line?with?lymphaticmetastasis?potential，BxPC-3-LN)，已于2011年10月28日保藏，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號：CGMCC?No.5421，分類命名：一種淋巴道高轉(zhuǎn)移活性的人胰腺癌細胞系BxPC-3-LN。?

本發(fā)明通過下述步驟篩選和建立淋巴道高轉(zhuǎn)移細胞系(如圖2所示)：?

1、構(gòu)建裸小鼠人胰腺癌細胞株BxPC-3淋巴道自發(fā)性轉(zhuǎn)移模型?

(1)實驗裸小鼠6只，分別在其右后肢爪墊皮下接種1×10⁷個對數(shù)生長期BxPC-3細胞；?

(2)8-10周后待原位移植瘤最大徑＞2cm時，常規(guī)處理，取肉眼可見的(最大的)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶組織，制成單細胞懸液，200目篩洗濾收集細胞培養(yǎng)；?

(3)將上述步驟(2)獲得的細胞接種到另外6只實驗裸鼠(接種部位和細胞數(shù)同步驟(1))；?

(4)上述步驟反復(fù)6次，建立淋巴道轉(zhuǎn)移模型；?

2、單細胞克隆技術(shù)分離淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移亞系?

(1)將上述連續(xù)傳代法獲得的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶組織，分組培養(yǎng)，分別作為母系細胞；?

(2)細胞培養(yǎng)：BxPC-3淋巴轉(zhuǎn)移細胞在37℃，5％CO₂條件下，在含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，待細胞近長滿瓶底時進行傳代；?

(3)有限稀釋法稀釋細胞使其密度等于或少于10個細胞/ml；?

(4)加入96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)板各孔細胞數(shù)，挑選只含一個細胞的孔擴增、標(biāo)記、保存；?

3、細胞建系?

(1)測定單細胞克隆株電泳率；?

(2)流式細胞儀檢測單細胞克隆株的細胞周期；?

(3)腫瘤細胞克隆形成試驗；?

(4)細胞克隆株穩(wěn)定性實驗，連續(xù)傳代30次后特性仍穩(wěn)定，獲得淋巴道高轉(zhuǎn)移活性人胰腺癌細胞系BxPC-3-LN。?

本發(fā)明的淋巴道高轉(zhuǎn)移活性人胰腺癌細胞系BxPC-3-LN具有以下生物學(xué)特性：?