[發明專利]一種利用心肌素誘導間充質干細胞向平滑肌樣細胞分化的方法無效

申請號：	201110382760.X	申請日：	2011-11-28
公開（公告）號：	CN102391991A	公開（公告）日：	2012-03-28
發明（設計）人：	王楠;張同存;任光達;周臻	申請（專利權）人：	天津科技大學
主分類號：	C12N5/10	分類號：	C12N5/10;C12N15/85
代理公司：	天津盛理知識產權代理有限公司 12209	代理人：	王來佳
地址：	300457 天津市塘***	國省代碼：	天津;12
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種利用心肌誘導間充質干細胞平滑肌細胞分化方法
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【說明書】：

技術領域

本發明屬于干細胞領域，涉及一種誘導干細胞分化的方法，尤其是一種利用心肌素誘導間充質干細胞向平滑肌樣細胞分化的方法。

背景技術

血管損傷、缺血性疾病以及動脈瘤等，都需要合適的血管移植物，臨床上應用的血管移植物包括自體血管、異體血管和人工合成材料血管等，已很少使用或不適于替代小口徑血管。現今，主要利用組織工程學的方法構建血管替代物，目前構建組織工程血管所用的血管平滑肌細胞為來自臍動脈或大動物頸內動脈的成熟平滑肌細胞，是終末分化細胞，易老化，體外增殖能力差。因此，尋找新的種子細胞來源成了目前最迫切需要解決的問題。

骨髓間充質干細胞(Bone?mesenchymal?stem?cells，BMSCs)，是目前最有應用優勢的種子細胞。骨髓間充質干細胞具有非常強的自我增殖能力和分化的多潛能性，國內外的研究表明能根據特定的環境分化為平滑肌細胞，并且骨髓間充質干細胞具有其它干細胞所不可比擬的優點，如取材方便、增殖和分化能力強、移植無免疫原性，同時也避免了胚胎干細胞移植所面臨的倫理問題。如能通過誘導骨髓間充質干細胞定向分化為平滑肌細胞，將為在臨床上提供種子細胞從而治療血管損傷等疾病提供實驗依據。心肌素(Myocardin)是最新發現的血清反應因子(SRF)的協同轉錄因子，主要通過與SRF形成復合物，促進SRF結合在靶基因的CArG?box，激活相關基因的轉錄。Myocardin特異的在胚胎及成年心肌和平滑肌細胞(SMC)中表達，是心臟和平滑肌細胞發育和分化及基因特異性表達所必需的輔助因子。目前對間充質干細胞向平滑肌細胞誘導分化的方法并不很多，大多數為利用生長因子誘導分化，其誘導時間長，且分化效率有限。而利用Myocardin誘導人骨髓間充質干細胞向平滑肌細胞分化目前尚未見報道。既然Myocardin在平滑肌細胞的發育與分化中具有重要作用，因此利用基因修飾的方法在間充質干細胞中高表達myocardin很可能是體外獲得平滑肌細胞從而建構組織工程血管的重要發展方向。可以利用多種方法將Myocardin轉染到間充質干細胞中，利用脂質體轉染效率比較低，而以病毒為載體的介導方式在臨床應用中存在安全問題，因此迫切需要一種安全、高效的介導方法。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種利用心肌素誘導間充質干細胞向平滑肌樣細胞分化的方法，本發明中使用心肌素誘導間充質干細胞向平滑肌樣細胞分化，轉染系統轉染效率高、安全性好。

本發明實現目的的技術方案如下“

一種利用心肌素誘導間充質干細胞向平滑肌樣細胞分化的方法，將心肌素基因轉染入人骨髓間充質干細胞，誘導其向平滑肌樣細胞分化。

而且，構建含有心肌素基因的重組真核表達質粒，真核表達載體包括是pEGFP、pcDNA3.1或pCMV。

而且，包括如下步驟：

(1)分離、純化及擴增人骨髓間質干細胞，得到單細胞懸液；

(2)構建含有心肌素基因的重組真核表達質粒，真核表達載體可以是pEGFP、pcDNA3.1或pCMV；

(3)誘導人骨髓間充質干細胞向平滑肌樣細胞分化：當步驟(1)中細胞至70-80％融合時，用步驟(2)含有心肌素基因的重組真核表達質粒轉染細胞；

(4)將步驟(3)中轉染心肌素基因48小時后的細胞繼續培養，誘導分化為平滑肌樣細胞。

而且，步驟(4)中轉染心肌素基因的細胞培養條件為：5％v/v胎牛血清的DMEM/F12培養基中，在5％CO₂、飽和濕度、37℃的培養條件下。

而且，當骨髓間充質干細胞長滿孔板的70-80％的時候開始進行轉染。