[發明專利]一種抗體的高效表達載體及其制備方法

有效

• 申請號: 201110380100.8
• 申請日: 2011-11-25
• 公開（公告）號: CN102559750A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 陳倩怡;王笑非
• 申請（專利權）人: 佛山安普澤生物醫藥有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 顏希文

1.一種抗體的高效表達載體，其特征在于：該高效表達載體含有抗性基因和兩個基因整合用的目的基因結合位點，兩個目的基因結合位點能夠分別結合抗體分子的重鏈基因和輕鏈基因，兩個目的基因結合位點分別位于高效表達載體中的兩個表達單元中，分別形成抗體的重鏈表達單元和輕鏈表達單元，所述表達單元中還包括位于所述目的基因結合位點上游的強表達誘導性啟動子。

2.如權利要求1的所述的高效表達載體，其特征在于：所述高效表達載體中還包括復制起始位點，所述抗性基因包括位于所述復制起始位點的青霉素抗性基因和位于所述復制起始位點下游的新霉素抗性基因。

3.如權利要求2的所述的高效表達載體，其特征在于：所述復制起始位點與所述新霉素抗性基因之間包括新霉素抗性基因的即刻早期啟動啟動子。

4.如權利要求3的所述的高效表達載體，其特征在于：所述即刻早期啟動啟動子為猿猴病毒40即刻早期啟動啟動子。

5.如權利要求1的所述的高效表達載體，其特征在于：所述重鏈表達單元和輕鏈表達單元中均含有位于所述目的基因結合位點上游的巨細胞病毒啟動子。

6.如權利要求1的所述的高效表達載體，其特征在于：所述重鏈表達單元和輕鏈表達單元中均包括16S雜合內含子，16S雜合內含子位于啟動子與基因結合位點，其下游還包括16S拼接受體，16S雜合內含子和16S拼接受體能夠有助于抗體分子mRNA的成熟剪切。

7.如權利要求1的所述的高效表達載體，其特征在于：該高效表達載體還包括引入功能基因和抗體分子編碼基因的酶切位點。

8.一種抗體的高效表達載體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

一、pExp101的構建，pExp101全序列是經由DNA合成產生的SEQ?ID?NO：1，此質粒的骨架部分來自于pCI-Neo，包含青霉素抗性基因、復制起始位點，質粒功能區有猿猴病毒40啟動子，巨細胞病毒啟動子，SV40多聚腺嘌呤信號序列，SV40內含子；

二、pExp102的構建，在pExp101的基礎上，加入新霉素抗性基因而構建；

三、pExp103的構建，將具有SEQ?ID?NO：5序列的兔β-球蛋白聚腺苷酸化信號序列插入pExp101中，作為蛋白高表達質粒的中間體；

四、pExp104的構建，將一個完整的CMV表達單元裝入pExp102；

五、pExp105的構建，將抗CD20抗體gamma鏈cDNA序列SEQ?ID?NO：11插入pExp103中CMV表達單元，即獲得pExp105，此質粒為構建雙基因表達單克隆抗體的表達質粒的前體；?

六、pExp106的制備，將抗CD20抗體kappa鏈cDNA序列SEQ?ID?NO：14插入pExp104中CMV表達單元，即獲得pExp106，此質粒為構建雙基因表達單克隆抗體的表達質粒的前體；

七、pExp110的構建，通過整合pExp105和pExp106，將兩個分別表達單克隆抗體gamma鏈和kappa鏈基因的表達盒整合到一個質粒中生成。

9.如權利要求8所述高效表達載體的制備方法，其特征在于：所述新霉素抗性基因具有SEQ?ID?NO：2的序列，其由PCR法從pSV2-Neo質粒中獲取。

10.如權利要求8所述高效表達載體的制備方法，其特征在于：步驟四中CMV表達單元是從pExp101由PCR擴增得到的具有如SEQ?ID?NO：8所示序列。?