[發明專利]一種甘露聚糖酶重組表達載體和一種可自身分泌甘露聚糖酶轉基因豬的培育方法

無效

• 申請號: 201110374866.5
• 申請日: 2011-11-23
• 公開（公告）號: CN103122358A
• 公開（公告）日: 2013-05-29
• 發明（設計）人: 李紫聰;劉德武;張茂;石俊松;周榮;吳珍芳
• 申請（專利權）人: 吳珍芳
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/877;A61D19/04;A01K67/027
• 代理公司: 廣州天河恒華智信專利代理事務所(普通合伙) 44299
• 代理人: 區長釗

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及轉基因工程技術，具體涉及一種甘露聚糖酶重組表達載體，以及利用該重組表達載體來培育可自身分泌甘露聚糖酶的轉基因豬的方法。

背景技術

豬飼料中最主要的成分是玉米和豆粕等，這些谷物籽實是屬于植物性飼料原料。植物含大量的纖維素、半纖維素及果膠聚糖等非淀粉多糖，因為它們是植物細胞壁的主要成分,甘露聚糖是植物性飼料原料中主要的一種非淀粉多糖。

研究發現，豬自身不能產生甘露聚糖酶。由于寄生于消化道的微生物種類和數量遠少于牛或羊等多胃動物，豬也無法依靠消化道中的微生物分泌足量的甘露聚糖酶來降解飼料中植物細胞壁的甘露聚糖。因此，豬飼料中谷物籽實細胞內的營養物質在消化道中無法被充分釋放出來供豬消利用。另一方面，由于甘露聚糖是可溶性非淀粉多糖，在豬消化道中難以消化的甘露聚糖會與大量的水結合，使食糜的黏稠度增加，從而降低豬消化道對食糜中營養成分的消化和吸收效率。可見，由于豬自身不能分泌甘露聚糖酶，植物性飼料原料中的甘露聚糖對豬來說就成為一種抗營養物質，它不但降低了豬對飼料營養物質的消化、吸收和利用效率，還增加了豬糞便中各種污染物，如氮、硫等的排放，對環境造成更大破壞。

????為了消除甘露聚糖對豬的抗營養作用，目前采用的主要方法是在豬飼料中添加通過微生物發酵生產的甘露聚糖酶。雖然部分研究證明在飼料中添加甘露聚糖酶可以提高豬對飼料營養物質的消化和吸收效率，并提高豬的生長性能，減少糞便中污染物排放，但是在飼料中添加甘露聚糖酶增加了飼料成本，降低了養豬利潤。此外，由于飼料在制備過程通常有些工序需要在特殊條件下（例如高溫）完成，這容易造成添加的甘露聚糖酶產生部分酶活損失，導致其水解飼料中甘露聚糖的效果不穩定或不理想。

因此，非常有必要開發更有效，更低廉的技術來消除豬飼料中甘露聚糖的抗營養作用，提高豬對飼料的消化和吸收效率，從而提高豬的生長性能及減少糞便中污染物的排放。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種由甘露聚糖酶基因和調控元件拼接后，插入到真核表達載體后所形成的，能夠受調控元件調控表達甘露聚糖酶的甘露聚糖酶重組表達載體。

本發明的另一個目的在于提供利用上述甘露聚糖酶重組表達載體來培育可自身分泌甘露聚糖酶豬重構胚的方法。

本發明的另一個目的在于提供利用由上述甘露聚糖酶重組表達載體培育的重構胚進行轉基因豬培育的方法。

本發明的上述目的是通過如下方案予以實現的：

一種甘露聚糖酶重組表達載體，該重組表達載體是將外源的甘露聚糖酶基因和調控元件拼接后，插入到真核表達載體中，構建得到由調控元件調控表達的甘露聚糖酶重組表達載體。

上述甘露聚糖酶重組表達載體中，調控元件的作用是調控外源甘露聚糖酶在豬消化道組織特異表達，該調控元件可以為口腔組織特異表達的調控元件或腮腺組織特異表達的調控元件，也可以為胃組織特異表達的調控元件或腸組織特異表達的調控元件。

上述甘露聚糖酶重組表達載體中，外源的甘露聚糖酶基因是指任何一種本領域中已經公開的甘露聚糖酶基因，如來源于微生物、酵母或昆蟲等的甘露聚糖酶基因。

上述甘露聚糖酶重組表達載體中，真核表達載體采用任何一種本領域技術人員常用于動物基因工程中的，并帶有可在真核細胞表達的藥物抗性基因（如新霉素基因等等）的真核表達載體，如真核表達載體pCMVp-NEO-BAN、真核表達載體pEGFP、真核表達載體pEGFT-Actin、真核表達載體pcDNA^TM3.1/myc?His或真核表達載體pcDNA6/His^TM等等；藥物抗性基因的作用是可用于篩選作為核供體細胞的轉基因細胞。

一種培育可自身分泌甘露聚糖酶豬重構胚的方法，該方法包括如下步驟：

步驟1

將上述的甘露聚糖酶重組表達載體轉染豬胎兒成纖維細胞并經篩選后制備成轉甘露聚糖酶基因的核供體細胞；

制備去核豬卵母細胞；

步驟2

將步驟1制備的核供體細胞注入步驟1制備的去核豬卵母細胞中形成重構胚；

將上述重構卵進行激活處理后，得到激活的重構胚。

上述步驟1中，核供體細胞可以用任意一種豬體細胞，但本發明人通過研究后發現，用豬胎兒成纖維細胞更有利于提高用克隆法制備轉基因豬的效率。

上述步驟2中，將核供體細胞注入去核豬卵母細胞中，其注入方法采用顯微注射的方法。

上述步驟2中，對重構卵進行激活處理，是采用電激活方法。