[發(fā)明專利]一類雙芐基五甲川菁熒光染料、其制備方法及應用

有效

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• 申請日: 2011-11-22
• 公開（公告）號: CN102516793A
• 公開（公告）日: 2012-06-27
• 發(fā)明（設計）人: 樊江莉;安德魯·李;彭孝軍;強新新;王倩
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: C09B23/08
• 分類號: C09B23/08;C09K11/06;G01N21/64;C12Q1/02
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司 21212
• 代理人: 劉曉琴

技術領域

本發(fā)明涉及一類雙芐基五甲川菁熒光染料，其制備方法以及作為特異性熒光探針在活細胞和固定細胞標記中的應用。

背景技術

線粒體是一種普遍存在于真核細胞中的細胞器，各種生命活動所需的能量大部分都是靠線粒體中合成的ATP提供的，因此有細胞的“動力工廠”之稱。目前商品化的線粒體熒光探針主要有：JC-1、Rhodamine?123及系列探針。其中，JC-1應用最為廣泛。它在濃度或線粒體膜電位低時，以單體存在，激發(fā)波長為490nm，發(fā)射波長為527nm，呈綠色熒光。當濃度升高或線粒體膜電位升高時，JC-1形成J-聚體，呈橙色熒光，此時激發(fā)波長為490nm，發(fā)射波長為590nm。JC-1最重要的應用是檢測活細胞內線粒體的膜電位，以及追蹤凋亡細胞中的線粒體變化。Rhodamine?123是一種能滲透入細胞，帶陽離子的熒光探針。它的激發(fā)波長為505nm，發(fā)射波長為534nm。活細胞攝取Rhodamine?123達到平衡的速度較快，只需5分鐘，通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，即可見到線粒體被Rhodamine?123染成綠色。當細胞被反復沖洗時，Rhodamine?123通常不被細胞保留，但許多癌細胞可較長時間保留這種染料，因此，它有助于某些癌癥的診斷。但是，一旦線粒體的膜電位損失，它們就很容易被洗掉。這就限制了某些應用。系列探針則是Invitrogen專為線粒體而設計，具有細胞通透性，能被動滲透質膜，在有活性的線粒體中積累。盡管有些MitoTracker探針能實現(xiàn)固定細胞中的線粒體標記，但在很短的時間內就會勻染整個細胞，所以這些染料還是只推薦給活細胞。

因此，目前的線粒體熒光探針都存在著不同的缺點，如受線粒體膜電位控制、不能標記固定細胞中的線粒體等。更為重要的是，這些探針的吸收和發(fā)射波長均在可見光區(qū)(490-530nm)，而生物樣品在這個區(qū)域有很強的吸收和熒光發(fā)射，這會造成熒光檢測效率大大降低。

隨著生物技術和熒光標示技術的飛速發(fā)展，由于菁染料具有摩爾消光系數(shù)大，吸收和發(fā)射波長隨著染料共軛鏈的長度可調，與生物分子結合后熒光較強，細胞毒性小等特點，已成為在DNA、蛋白質及核酸等分析檢測中使用的主要熒光探針。五甲川菁染料Cy5的吸收、發(fā)射波長在600nm以上，接近近紅外區(qū)域，是波長最短的近紅外菁染料，作為新一代的商品化熒光標示劑，在蛋白標記、DNA測序、離子中性小分子識別、細胞以及活體組織成像方面得到了很廣泛的應用。但到目前為止，還沒有文獻報道五甲川菁染料用于熒光特異性標記細胞內線粒體。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供光譜范圍在近紅外光區(qū)、能夠在活細胞和固定細胞中對線粒體進行熒光標記的、結構簡單性能優(yōu)良的基于五甲川菁染料的探針分子，

本發(fā)明的目的之一在于提供一類雙芐基五甲川菁熒光染料，具有如下結構通式I：

通式I中，X^-選自鹵素負離子、ClO₄^-、PF₆^-、CF₃^-、BF₄^-、R₁CO₂^-、R₂SO₃^-或OTs^-，

其中R₁和R₂各自獨立地選自C_1-12的烷基或芳基。

優(yōu)選的技術方案中，所述的R₁和R₂各自獨立地選自C_1-6的烷基。

更進一步優(yōu)選，通式I中，X^-選自鹵素負離子，最優(yōu)選Cl^-、Br^-、I^-。

本發(fā)明另一方面的目的在于提供上述本發(fā)明的雙芐基五甲川菁熒光染料的制備方法，是使用通式化合物II與化合物III(縮合劑丙二醛縮苯胺鹽)在堿存在條件下反應所得，反應溶劑是酸酐，反應溫度20～150℃，反應時間10～100分鐘。其中優(yōu)選的反應時間是30～50min。