[發(fā)明專利]一種從發(fā)酵液中分離提取高純度布雷菲德菌素A的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110370278.4
• 申請日: 2011-11-18
• 公開（公告）號: CN102399210A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄭裕國;王亞軍;吳燁飛;薛鋒;吳植獻(xiàn);沈寅初
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C07D313/00
• 分類號: C07D313/00
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種從發(fā)酵液中分離提取高純度布雷菲德菌素A的方法。

(二)背景技術(shù)

布雷菲德菌素A(Brefeldin?A)是一種天然存在的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，化學(xué)名[(1R，2E，6S，10E，11as，14aR)-1，6，7，8，9，11a，12，13，14，14a-Decahydro-1，13-dihydroxy-6-methyl-4H-cyclopent[f]oxacyclotridecin-4-one]，分子式為C₁₆H₂₄O₄，分子量約280，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：

1958年，首次報道從Penicillium?decumbens發(fā)酵液中分離得到布雷菲德菌素A(Singleton等，1958)。早期研究發(fā)現(xiàn)，布雷菲德菌素A抑制蛋白質(zhì)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體復(fù)合物轉(zhuǎn)運過程，具有抗細(xì)菌、抗真菌和抗病毒性質(zhì)。布雷菲德菌素A作為一種蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑，能夠影響蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運、加工過程，已成為細(xì)胞生物學(xué)家研究哺乳動物細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要分子工具，具有一定的市場需求。1963年，NCI發(fā)現(xiàn)，在小鼠腫瘤模型上布雷菲德菌素A表現(xiàn)出抗腫瘤活性，小鼠的LD₅₀大于200mg/kg。研究發(fā)現(xiàn)，布雷菲德菌素A通過不依賴于p53凋亡機(jī)制誘導(dǎo)人前列腺癌細(xì)胞凋亡，Akira等聯(lián)合使用低劑量布雷菲德菌素A提高吉西他濱(Gemcitabine)對人胰腺癌細(xì)胞MIA?PaCa-2細(xì)胞線的作用效果。此外，布雷菲德菌素A及其化學(xué)衍生物具有除草活性。

布雷菲德菌素A生產(chǎn)方法分為化學(xué)合成法和發(fā)酵法?；瘜W(xué)法合成布雷菲德菌素A具有反應(yīng)步驟冗長、收率低等缺陷；發(fā)酵法生產(chǎn)布雷菲德菌素A具有高效和環(huán)境友好的特點。文獻(xiàn)報道產(chǎn)布雷菲德菌素A的菌種包括青霉屬(Penicillium)、斜臥青霉(Penicillium?decumbens)、藍(lán)青霉(Penicillium?cyaneum)、苜蓿假盤菌(Phyllosticta?medicaginis)、殼二孢屬(Ascochyta)、擬青霉(Paecilomyces?sp.)、布雷正青霉(Eupenicillium?brefeldianum)、棒曲霉(Aspergillus?clavatus)、分支孢屬(Cladosporium?sp.)、鏈格孢菌屬(Alternaria?zinniae)、莖點霉屬(Phoma)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces?sp.)。

美國專利U.S.3896002公開了產(chǎn)布雷菲德菌素A的菌株苜蓿假盤菌(P.medicaginis)及布雷菲德菌素A制備過程。McCloud等(1995)在中試規(guī)模上，E.brefeldianum?ATCC?58665合成布雷菲德菌素A發(fā)酵單位達(dá)到169mg/L。趙玉芬等進(jìn)行了布雷菲德菌素A產(chǎn)生菌選育和布雷菲德菌素A結(jié)構(gòu)改造工作，她們報道的布雷菲德菌素A小試發(fā)酵水平為151.6mg/L。除制備工藝外，改性是布雷菲德菌素A研究的另一個熱點，美國專利U.S.6,362,218、U.S.5,824,674、U.S.5,696,154、U.S.5,112,607、U.S.4,608,078公開了布雷菲德菌素A的衍生化反應(yīng)及衍生物的生物學(xué)活性。

目前關(guān)于布雷菲德菌素A分離純化的文獻(xiàn)報道較少。Kim和Kochevar等(1995年)利用反相層析技術(shù)從發(fā)酵液中分離布雷菲德菌素A，但該項工作未報道具體的純化效果，而且，C18反相硅膠對布雷菲德菌素A的吸附能力較弱，且該填料售價高，導(dǎo)致整個分離工藝的效率低、經(jīng)濟(jì)性差。Gao等(2010年)建立高速逆流色譜(HSCCC)和電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)聯(lián)用的方法提取布雷菲德菌素A，該方法存在單批處理量小、成本高等缺陷，不能滿足大規(guī)模的高純度布雷菲德菌素A生產(chǎn)的要求。發(fā)明人在中國發(fā)明專利CN200810163775.5中報道了蒸發(fā)結(jié)晶工藝，蒸發(fā)結(jié)晶技術(shù)從發(fā)酵液中制備布雷菲德菌素A工藝單次結(jié)晶產(chǎn)物純度低，呈淡黃色，必須依賴重結(jié)晶才能制備99.0％純度的晶體。而且，蒸發(fā)結(jié)晶制備的布雷菲德菌素A晶體晶型不規(guī)則，仍含有一定的色素殘留，晶體品質(zhì)較差，不能滿足生物試劑對品質(zhì)的高要求。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)上的缺陷與不足，提供一種設(shè)備簡單、分離過程環(huán)境友好、產(chǎn)物綜合收率高、晶體純度高(99％以上)、晶體規(guī)則且工藝易控制和放大的布雷菲德菌素A的提取方法。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：