[發(fā)明專利]制備轉(zhuǎn)TGEV-S基因玉米的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110365335.X
• 申請日: 2011-11-17
• 公開（公告）號: CN103114105A
• 公開（公告）日: 2013-05-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王金洛;張曉東;楊兵;曾作財;許承楊
• 申請（專利權(quán)）人: 北京市農(nóng)林科學(xué)院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/66;A01H5/00;A61K36/899;A61P31/14;A61K127/00
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及制備轉(zhuǎn)TGEV-S基因玉米的方法。

背景技術(shù)

豬傳染性胃腸炎(Transmissible?Gastroenteritis，TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible?Gastroenteritis?Virus，TGEV)引起的，該病是以嘔吐、嚴(yán)重腹瀉、脫水和對2周齡以內(nèi)仔豬高度致死性為特征的高度接觸性傳染病，不同品種和年齡的豬均易感。TGE主要危害新生仔豬，隨著日齡的增大，該病的死亡率逐漸下降，16日齡以上仔豬的死亡率為10％左右。5周齡以上仔豬死亡率更低，成年豬幾乎沒有死亡，但往往會造成生產(chǎn)性能下降，飼料報酬率降低，經(jīng)濟(jì)損失較大。豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白(TGEV?S蛋白)形成病毒粒子表面的突起，攜帶主要的B淋巴細(xì)胞抗原決定族，是唯一能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體和提供免疫保護(hù)作用的結(jié)構(gòu)蛋白。TGEV?S抗原分為A，B，C和D共4個抗原位點，有研究成果證明這四個抗原位點均位于S蛋白N端的543個氨基酸殘基之內(nèi)。

隨著植物基因工程技術(shù)的發(fā)展，利用轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)動物或人基因工程疫苗應(yīng)用在疾病的預(yù)防及治療方面已成為植物基因工程的一個新興研究領(lǐng)域。和細(xì)菌、酵母及哺乳動物細(xì)胞等傳統(tǒng)疫苗生產(chǎn)系統(tǒng)相比較而言，用轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)基因工程疫苗具有以下幾個方面的優(yōu)勢：①植物細(xì)胞具有全能性，能夠再生植株且易于成活；②植物細(xì)胞完整的真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)使表達(dá)產(chǎn)物具有較好的免疫原性及生物活性；③植物細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和細(xì)胞器的天然生物膠囊作用能避免抗原蛋白在消化道中被降解，有效地誘導(dǎo)腸胃黏膜免疫反應(yīng)，同時又能起到一定的緩釋作用，這使得植物疫苗口服給藥比經(jīng)注射給藥效果更明顯。④口服植物疫苗能誘導(dǎo)粘膜免疫反應(yīng)。以上這些優(yōu)點使轉(zhuǎn)基因植物口服疫苗適合應(yīng)用于通過提高體液免疫特別是腸道免疫水平來預(yù)防病原的感染。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的是提供一種在植物中表達(dá)TGEV?S蛋白的方法。

本發(fā)明所提供的在植物中表達(dá)TGEV?S蛋白的方法，包括如下步驟：將TGEV?S蛋白的編碼基因?qū)氤霭l(fā)植物，得到表達(dá)所述TGEV?S蛋白的轉(zhuǎn)基因植物。

上述方法中，所述出發(fā)植物為玉米。

上述方法中，所述編碼基因為如下1)或2)或3)或4)所示：

1)其核苷酸序列是SEQ?ID?NO：2中自5′末端第1-2208位核苷酸所示DNA分子；

2)其核苷酸序列是SEQ?ID?NO：2所示DNA分子；

3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；

4)與1)或2)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。

上述方法中，所述編碼基因是通過如下所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入的。

上述方法中，所述TGEV?S蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于制備轉(zhuǎn)基因玉米的重組表達(dá)載體。

本發(fā)明所提供的重組表達(dá)載體，按照如下方法制備：用SacI和EcoRI雙酶切載體pBI221，回收農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因NOS3′末端終止子片段，再將其插入載體pSP72的SacI和EcoRI位點間，得到重組載體，計作pBPC18；

將E35S啟動子插入pBPC18的HindIII和XbaI位點，得到中間重組載體1；將Hsp70?intron1用BglII和BamHI酶切后插入所述中間重組載體1的BamHI位點，得到重組載體，計作pBAC154；

將所述TGEV?S蛋白的編碼基因插入載體pBAC154的BamHI和SacI位點，得到重組載體，計作pBAC175；

用HindIII和BamHI酶切質(zhì)粒pBARGUS，回收含有CaMV?35S啟動子和玉米Adh1內(nèi)含子的目的片段，再將其插入到pSP72的HindIII和BamHI位點，得到中間重組載體2；將編碼抗除草劑草甘膦的玉米EPSP基因插入中間重組載體2的BamHI和EcoRI位點，獲得重組載體，計作pSHK49；

將pSHK49用EcoRI酶切后補成平端，引入含HindII位點的適配子序列，計作pSHK49H3；所述適配子序列具體為CCCAAGCTTGGG；

用HindII酶切pSHK49H3，回收含有CaMV?35S啟動子和玉米Adh1內(nèi)含子和EPSP基因的片段，將其插入到pBAC175的HindIIII位點，得到目的重組表達(dá)載體。