[發明專利]一種多色標記活體病毒顆粒的方法

有效

• 申請號: 201110358688.7
• 申請日: 2011-11-14
• 公開（公告）號: CN102492662A
• 公開（公告）日: 2012-06-13
• 發明（設計）人: 何治柯;王漢中;周鵬
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N7/02;C12N15/62;C12N15/866
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

1.一種多色標記活體病毒顆粒的方法，其步驟如下：

(1)借助病毒展示系統，將綠色熒光蛋白與病毒囊膜蛋白GP64融合表達，構建出GP64上帶有綠色熒光蛋白的重組病毒；

根據GenBank中AcMNPV基因組序列用引物設計軟件Primer?premier?5，設計EGFP/gp64基因表達引物，在gp64的5’和3’分別加入EcoR?I和HindIII兩個酶切位點，首先，以提純的pEGFP-N1質粒作為模版，FEG1和REG-G為引物進行PCR擴增；將得到的PCR產物EGP0作為模板，以FN2和REG-G為引物再次進行PCR擴增，得到一段包含GP64信號肽和EGFP序列的片段，命名為EGP1，然后以提純的Bacmid?DNA為模板，FG-EG和RG為引物進行PCR擴增，得到一段包含有gp64肽段序列的片段，命名為EGP2，EGP1的3’端加入的27個EGP2的5’端序列由引物REG-G引入，EGP2的5’端加入的24個EGP1的3’端序列由引物FG-EG引入，這樣EGP1和EGP2就有了24個互補堿基，OverlapPCR實驗以EGP1和EGP2為模板，FN2和RG為引物，擴增出在gp64信號肽序列后面融合有EGFP序列的片段，命名為EGFP/gp64，PCR反應體系如下：

將連接反應產物電轉化入大腸桿菌DH5α感受態細胞中制備質粒EGFP/gp64-T?Easy?Vector，限制性內切酶EcoR?I和HindIII雙酶切供體質粒EGFP/gp64-T?Easy?Vector和表達載體pFastBac1，酶切產物經凝膠電泳顯示出大小不同的片段，在紫外燈下切取與EGFP/gp64片段和酶切后的pFastBac1片段大小相符合的膠帶，回收DNA片段，純化回收后在4℃進行連接反應，EGFP/gp64片段插入到表達載體pFastBac1相應的多克隆位點中；雙酶切在37℃條件下進行3h，反應體系如下：

連接反應體為4℃過夜反應，兩片段的加入量根據兩片段的濃度和大小對作調整，反應體系如下：

連接產物電轉化入制備好的大腸桿菌DH5α感受態細胞中，在含有100μg/mL氨芐青霉素和100μg/mL卡那霉素的平板上進行藍白斑篩選，提取白色菌落的質粒DNA，進行EcoR?I-HindIII雙酶切鑒定，命名為pFastBac1-EGFP，以50％甘油/菌液體積比3∶7存于-80℃冰箱中；

將pFastBac1-EGFP轉座入野生型桿狀病毒全基因組Bacmid中，操作步驟如下：將凍存的DH10Bac感受態細胞從冰箱中取出，在冰浴中加入1μLpFastBac1-EGFP質粒DNA，兩者輕輕混勻后轉移到預冷的轉化杯中，在電轉化儀上轉座，操作電壓為1800V，電轉化成功后快速向轉化杯中加入0.8mL?SOC培養基，混勻的混合物轉移到EP管中37℃，200rpm搖床培養4h，取5μL菌液加入20mg/mL的X-gal?40μL和200mg/mL的IPTG?4uL，涂于含有100μg/mL卡那霉素和100μg/mL慶大霉素的固體培養平板上，將平板倒置于37℃培養，16-24小時后進行藍白斑篩選；用接種環挑取平板上的白色菌落，在100μg/mL卡那霉素和100μg/mL慶大霉素的平板上再次進行藍白斑篩選，挑取平板上的白色菌落，分別接種于含有100μg/mL卡那霉素和100μg/mL慶大霉素的LB液體培養基中，37℃搖床培養過夜，沾取各管中菌液，用M13Forward和M13Reverse引物、以及M13Forward和RG引物或者FN2和M13Reverse引物對菌液進行PCR鑒定，命名為Bacmid-EGFP，以50％甘油/菌液體積比3∶7存于-80℃冰箱中；

PCR體系為：

鑒定為正確的克隆重新轉接到含有100μg/mL卡那霉素和100μg/mL慶大霉素的LB液體培養基中培養，16-24小時后提取整管菌液質粒，轉染Spodopterafrugiperda細胞得第一代病毒，提取Bacmid-EGFP質粒的步驟為：將菌液倒入1.5mL的eppendorf管中，5,000rpm離心2min后倒掉上清，繼續倒入試管中剩下的菌液，重復操作三次直至菌體完全沉淀；加入300μL溶液I振蕩打散菌體沉淀；加入300μL溶液II，反復顛倒三到四次至混勻，靜置至澄清；加入300μL提取Bacmid的溶液III，顛倒混勻，冰上放置5min；12,000rpm離心15min，吸取上清轉到另一個1.5mL的eppendorf管中；加入800μL異丙醇，-20℃放置25min后12,000rpm離心15min；倒掉上清，加入70％體積比的乙醇1mL，12,000rpm離心5min；徹底去除上清，室溫干燥，加入20μL?ddH₂O溶解；

sf9細胞傳代到35mm小皿中，在含有10％質量體積比胎牛血清的Grace’s培養基中于28℃無CO₂條件下培養至貼壁，轉染前用無血清Grace’s培養基洗兩次，準備轉染液：A溶液：16μLBacmid-EGFP質粒與84μL無血清Grace’s培養基混合均勻，B溶液：8μLlipofectamine與92μL無血清Grace’s培養基混合均勻，B溶液逐滴加入A溶液中產生脂類-DNA復合物，20-25℃靜置45min，每隔5min用手彈勻，每支復合物加入800μL無血清Grace’s培養基，抽吸混勻，滴加入待轉染的sf9細胞中，置于23℃無CO₂培養箱中培養6-7個小時，吸出轉染混合物，加入2mL含有10％質量體積比胎牛血清的Grace’s培養基，置于23℃無CO₂培養箱中培養，6天后收集第一代重組病毒，命名為Bac-EGFP；

(2)金屬配合物[Ru(phen)₂(dppz)]²⁺溶液加入10％質量體積比胎牛血清的Grace’s培養基中培養sf宿主細胞；將步驟1所構建的重組病毒Bac-EGFP加入培養的宿主細胞中在25℃條件下進行病毒感染，增殖，操作為：sf9細胞在含有10％質量體積比胎牛血清的Grace’s培養基中生長至70％大皿底面積時用于擴增病毒，先吸出部分培養基，使余下的培養基剛好淹沒細胞，加入500mL第一代重組病毒，置于23℃無CO₂培養箱中感染1.5h，每隔半個小時晃動一下，感染后的細胞加入6mL含有10％質量體積比胎牛血清的Grace’s培養基，置于23℃無CO₂培養箱中培養，4天后收獲子代病毒；

(3)收集，純化雙色標記的子代病毒顆粒，得到的子代病毒通過透射電鏡，電感耦合等離子體質譜和激光掃描共聚焦顯微鏡表征其結構，測量其單顆病毒金屬配合物含量及展示其單顆病毒的雙熒光信號。

2.根據權利要求1所述的一種多色標記活體病毒顆粒的方法，其特征在于：所述的溶液I：50mmol/L的葡萄糖，25mmol/L的Tris-Cl，10mmol/L的EDTA，終pH?8.0；溶液II：0.2mol/L的NaOH，1％SDS，新鮮配制；溶液III：5mol/L的乙酸鉀60mL，冰乙酸11.5mL，水28.5mL；提取Bacmid的溶液III：3mol/L的乙酸鉀，終pH5.5。