[發明專利]制備IGF2b轉基因魚的慢病毒方法

無效

• 申請號: 201110356210.0
• 申請日: 2011-11-11
• 公開（公告）號: CN102363792A
• 公開（公告）日: 2012-02-29
• 發明（設計）人: 張成鋒;董在杰;朱健;邴旭文;蘇勝彥
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院淡水漁業研究中心
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;A01K67/027
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀昌

技術領域

本發明涉及一種制備IGF2b轉基因魚的慢病毒方法的方法。

背景技術

目前，生產轉基因動物的方法有原核內顯微注射法、精子載體法、脂質體轉染法、反轉錄病毒載體法、以及細胞核移植方法，但這些方法皆因成本高、轉基因效率低或者插入片段小等缺點而無法廣泛應用。慢病毒載體法的出現，不僅克服了以往逆轉錄病毒表達沉默的缺陷，而且轉基因的效率遠遠高于傳統的顯微注射法，是轉基因動物研究領域的突破性進展。隨后，利用該方法，已經有轉基因豬、轉基因牛、轉基因鼠、轉基因雞、綿羊、獼猴等出生。

在我國，朱作言等就通過顯微注射的方法獲得了轉草魚生長激素的轉基因鯉魚，黑龍江水產研究所也通過同樣的方法獲得了轉大馬哈生長激素基因的轉基因鯉魚，而使用慢病毒生產轉基因鯉魚還未見報道。因此，本發明期望獲得轉基因鯉魚的慢病毒方法。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中存在的不足，提供一種基于慢病毒的轉基因鯉魚生產方法，該處理方法既能提高轉基因的效率，又能降低轉基因鯉的生產成本。

本發明為實現上述目的，采用如下技術方案：

制備IGF2b轉基因魚的慢病毒方法，其特征在于：首先構建所要轉基因的慢病毒載體，其次，獲得人工授精的鯉魚未分裂的受精卵并進行脫粘處理；使用顯微注射的方式進行慢病毒注射；

具體操作步驟為：

制備IGF2b轉基因魚的慢病毒方法，其特征在于按如下步驟實現：

（1）、根據鯉魚IGF2b基因cDNA序列Genbank登錄號為AF402958，設計引物：

IGF2b-BamHI-F，GATCATACGGATCCGCCACCATGGAGGACCAACTAAAACATCA

IGF2b-NheI-R，CAGTTGACGCTAGCTCATCGACTCTGTGCAAAAAGG；

擴增其CDS區

ATGGAGGACCAACTAAAACATCATTCTTTGTGCCATACTTGTTTGAGAACAGACAGTGTCATAAATAAGG

TCATAAAGATGTACTGGTCCATACGAATGCCCATATGCATACTGTTTTTAACCCTGTCTGCCTTCGAAGT

GGCTTCAGCTGAAACGTTATGCGGCGGAGAGCTGGTGGACGCGCTACAGTTTGTGTGTGGAGACAGAGGT

TTCTATTTCAGTCGACCAACTAGCAGGTTGAGCAGTCGACGTTCTCAAAATCGTGGGATTGTGGAAGAGT

GTTGTTTTAACAGTTGTAACCTAGCTCTTCTAGAACAGTACTGCGCTAAACCTGCCAAGTCAGAGAGGGA

CGTTTCAGCCACATCCCTACAGGTCATCCCGGTGATGCCCACATTAAAACAGGAGGTCCCAAGAAAACAT

GTGACCGTGAAATATTCCAAATACGACATGTGGCAACGAAAGGCCGCCCAGAGGCTACGGAGGGGCGTCC

CCGCCATCCTGCGGGCCAAGAAGTTTAGGCGGCAGGCGGAGAGAATCAGGGCCCAAGAGCAACTGCACCA

CCACAGGCCTCTCATCACGCTTCCCAGCAAGCTCCCGCCCATCCTTTTTGCACAGAGTCGATGA，

用Trizol（購自南京基天生物）抽提2個樣品中的RNA，反轉錄成cDNA；PCR擴增條件優化：用Taq?DNA?polymerse(Fermentas)（購自上海英駿英駿生物技術有限公司）擴增目的片段，摸索PCR條件；以cDNA為模板，用高保真酶擴增目的片段，PCR體系如下：