[發明專利]人PTEN基因的啟動子及其用途

無效

• 申請號: 201110355654.2
• 申請日: 2011-11-10
• 公開（公告）號: CN102465127A
• 公開（公告）日: 2012-05-23
• 發明（設計）人: 王雄彪;倪振華;陳清閣
• 申請（專利權）人: 上海中醫藥大學附屬普陀醫院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/63;C12N15/66;C12Q1/68;C12Q1/66
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，涉及人PTEN基因的啟動子的克隆及應用。

背景技術

第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白基因(phosphatase?and?tensin?homolog?deletedon?chromosome?ten，PTEN)是于1997年發現的第一個具有磷酸酶活性的抑癌基因，研究發現PTEN不僅與肺癌的發生、發展關系密切，與其他呼吸系統疾病，如支氣管哮喘等也有著一定的關系。

現有技術公開了PTEN的基因序列，其位于染色體10q23.31，全長200kb，其成熟蛋白是由403位氨基酸構成的一條多肽鏈，相對分子質量為56KD；通過對氨基酸開放讀碼框(openreading?frame，ORF)的序列分析，提示它含有一個酪氨酸磷酸酶域，以及一個與雞張力蛋白和牛輔助蛋白同源的大區域；它還包括一個C2域，該域在PTEN與膜的結合中發揮作用，也在調控細胞遷移中發揮一定的作用；在PTEN的結構中，還存在一個有三個氨基酸序列的C端，可結合Psd-95/Dlg/ZO-1(PDZ)域(由90個氨基酸殘基組成的重復序列，因最早發現于Psd-95、Dlg和ZO-1而命名，又稱為GLGF重復子)，并與恢復PTEN的膜結合有密切關系。

研究發現PTEN參與了小鼠哮喘的發病機制。在卵蛋白(OVA)誘發的哮喘小鼠模型中，PTEN蛋白表達和活性均降低，在給予PI3K抑制劑(渥曼青霉素)或PTEN腺病毒cDNA后，可明顯減少嗜紅細胞水平和氣道炎癥，即上調PTEN表達能治療哮喘。在過敏原誘發的哮喘小鼠模型給予PPAR-γ促效劑或PPAR-γ腺病毒后，PTEN表達上調。通過測量Akt磷酸化水平的減少發現該上調與PI3K活性降低有關。該實驗表明PPAR-γ在哮喘發病學中，通過調節PTEN表達而起到保護作用。上述研究結果表明PTEN參與了人類哮喘的發病機制。

哮喘是世界公認的醫學難題，被世界衛生組織列為疾病中四大頑癥之一。與哮喘相關的癥狀有咳嗽、喘息、呼吸困難、胸悶、咳痰等。典型的表現是發作性伴有哮鳴音的呼氣性呼吸困難。嚴重者可被迫采取坐位或呈端坐呼吸，干咳或咯大量白色泡沫痰，甚至出現紫紺等。哮喘癥狀可在數分鐘內發作，經數小時至數天，用支氣管擴張藥或自行緩解。早期或輕癥的患者多數以發作性咳嗽和胸悶為主要表現。

盡管哮喘的治療在多方面取得了進步，但沒有根本性的突破，尤其遺憾的是中藥治療哮喘離被國際認可的距離很遠，個案成功缺少普遍意義，急需尋找新的突破點。盡管有哮喘動物模型，但耗費高、耗時長，且有種屬差異，而目前尚無好的體外研究模型，限制了藥物的高通量篩選。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于PTEN(第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白基因)的治療哮喘藥物的模型或者方法。

本發明提供了一種PTEN啟動子轉錄活性片段，該轉錄活性片段包括PTEN啟動子的-778至-1390區域，或者-1339至-2141區域。例如，該轉錄活性片段包括PTEN啟動子的-778至-2141區域。在本發明的一個實施例中，該轉錄活性片段是PTEN啟動子的-778至-1390區域；在另一個實施例中，是PTEN啟動子的-1339至-2141區域。

所述的PTEN全稱是第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白基因(phosphatase?andtensin?homolog?deleted?on?chromosome?ten)，其詳細介紹可以參見genbank數據庫NM_000314.4、NP_000305.3和Hs.500466。PTEN啟動子介紹也可以參見genbank數據庫上述鏈接。

所述的轉錄活性片段，可以按照PTEN啟動子的-778至-1390區域、或者-1339至-2141區域的序列，人工合成。

本發明還提供了一種含有上述PTEN啟動子轉錄活性片段的熒光報告載體。

所述的轉錄活性片段，可以先設計引物，進行聚合酶鏈反應擴增獲得所述的轉錄活性片段；然后將該轉錄活性片段連接到熒光報告載體。

其制備方法詳細包括以下步驟：

1)克隆了PTEN的啟動子區域