[發明專利]一株蘇云金芽孢桿菌ST8及其殺蟲基因和應用

有效

• 申請號: 201110352076.7
• 申請日: 2011-11-09
• 公開（公告）號: CN102363760A
• 公開（公告）日: 2012-02-29
• 發明（設計）人: 朱軍;李平;鄭愛萍;尹傳春;王世全;鄧其明;李雙成;王玲霞;劉懷年
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A01N63/00;A01N63/02;A01P7/04;C12N15/32;A01H5/00;C12R1/07
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地，涉及一種蘇云金芽孢桿菌ST8 及其殺蟲基因和應用。

背景技術

在人類生產過程中，蟲害是造成農業生產損失及影響人類健康的重 要因素，據FAO統計，全世界農業生產每年因蟲害造成的經濟損失高達 14％，病害損失達12％，草害損失達11％。損失額高達1260億美元，相 當于中國農業總產值的一半，英國的4倍多。農業類害蟲主要集中在鱗 翅目與同翅目之中，鞘翅目金龜甲總科內部分昆蟲，如蠐螬，也是重要 的世界性分布地下害蟲，危害雙子葉和單子葉糧食作物、多種蔬菜、油 料、芋、棉、牧草以及花卉和果、林等播下的種子及幼苗，并且為害期 長，從播種到收獲均能為害，造成缺苗斷壟，甚至絕收，還會影響品質。 大量調查表明，蠐螬在地下害蟲中為害居首位，占總地下害蟲量的 70-80％上。主要有暗黑鰓金龜(Holotrichia?parallela?Motschulsky)、華北 大黑鰓金龜(Holotrichia?oblita?faldermann)、銅綠麗金龜(Anomala? carpulenta?Motsch)等，在我國華北地區如河北、山東等地危害較為嚴重。

蘇云金芽孢桿菌(Bacillus?thuringiensis，簡稱Bt)是一種革蘭氏陽 性細菌，它的分布極為廣泛，在芽孢形成的同時可形成具有殺蟲活性的 由蛋白質組成的伴胞晶體，又名殺蟲晶體蛋白(Insectididal?crystal? proteins，簡稱ICPs)，ICPs是由cry基因編碼的，該蛋白對敏感昆蟲有 強烈毒性，而對高等動物和人無毒性。近幾十年來，Bt已廣泛應用于控 制多種鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等害蟲。此外，Bt還對膜翅目、同翅目、 直翅目、食毛目等多種害蟲及植物病原線蟲、螨類、原生動物有控害作 用。目前在農田害蟲、森林害蟲及衛生害蟲的防治中Bt已成為化學合成 農藥的有力替代品，Bt還是轉基因抗蟲工程植物重要的基因來源。

自1981年Schnepf從菌株HD-1Dipel中克隆了第一個能表達殺蟲活 性的基因以來，人們已經分離克隆了470多種ICPs的基因，根據編碼的 氨基酸序列同源性它們被分別確定為不同的群、亞群、類和亞類。迄今 發現的對蠐螬具有殺蟲活性的Bt基因主要有cry3、cry8、cry18、cry23、 cry37、cry43等類基因(Shu?C.，et?al.2009，Characterization?of?two?novel? cry8?genes?from?Bacillus?thuringiensis?strain?BT185.Current? Microbiology，58(4)：389-392.)，其中研究最多的是cry8類基因，cry8類基 因由1160-1210個氨基酸組成，分子量為128-137kDa，對金龜子科、象 甲科、葉甲科等多種鞘翅目害蟲具有特異的殺蟲活性(Crickmore?N.，et?al. 1998.Revision?of?the?nomenclature?for?the?Bacillus?thuringiensis?pesticidal? crystal?proteins.Microbiol?Mol?Biol?Rev，62：807-813)。1992年，Ohba等在 世界上首次從Bt菌株中篩選出對金龜子幼蟲具有特異殺蟲活性的新菌 株(Bt.subsp.japonensis?BuiBui)(Ohba?M.，et?al.，1992.Aunique?isolate?of? Bacillus?thuringiensis?serovar?japonensis?with?a?high?larvicidal?activity? specific?for?scarabaeid?beetles，Letters?in?Applied?Microbiology，14：54-57)， 1994年從中克隆了一種新的殺蟲基因cry8Ca(Sato?R.，et?al.1994.Cloning， heterologous?expression，and?localization?of?a?novel?crystal?protein?gene?from? Bacillus?thuringiensis?serovar?japonensis?strain?buibui?toxic?to?scarabaeid? insects.Curr.Microbiol.28：15-19)。美國Mycogen公司從Bt菌株PS50C 分離的Cry8Aa1和Cry8Ba1對花金龜Cotinis?sp有明顯的殺蟲活性(US? Patent?5554534)(Tracy?E.Michaels，Kenneth?E.Narva，Foncerrada，1994. Bacillus?thuringiensis?toxins?active?against?scarab?pests.USP5554534.)。美 國從Bt菌株中分離了兩種基因cry8Bb1和cry8Bc1基因，發現對馬鈴薯 甲蟲，西方玉米根葉甲，南方玉米根葉甲具有顯著的殺蟲效果并已用于 轉基因抗蟲玉米的開發(Abad，et?al.2002.Genes?encoding?novel?proteins? with?pesticidal?activity?against?Coleopterans.WO?02/34774?A2)。在我國， 河北省農科院植保所和河北農業大學近年先后篩選獲得多株對黃褐麗金 龜(A.exoleta)和銅綠麗金龜(A.corpulenta)的幼蟲具有特異殺蟲活性 的Bt菌株，室內生測死亡率均達100％(馮書亮等.2000.一株對金龜子 類幼蟲具有殺蟲活性的蘇云金桿菌新分離株.中國生物防治，16(2)： 74-78)。2004年中國農業科學院植物保護所Bt185分離了一株對暗黑鰓 金龜幼蟲高效(LC50，0.94cfu/ml)的菌株Bt185，并從中克隆了四個種 新的cry8類基因：cry8Ea1，cry8Ea2，cry8Fa1，cry8Ha1。目前絕大部分 此類殺蟲基因均被國外科研究機構或種子公司進行了專利保護；因此， 對這些Bt資源進行挖掘和開發是一項緊迫而又有價值的工作，擁有自主 知識產權，對于基因克隆、工程菌構建和抗蟲轉基因植物均具有重要的理 論意義和應用價值。