[發明專利]一種斑馬魚胚胎DNA錯配修復功能活性的分析方法及其應用

無效

• 申請號: 201110343124.6
• 申請日: 2011-11-03
• 公開（公告）號: CN102392073A
• 公開（公告）日: 2012-03-28
• 發明（設計）人: 董巧香;黃長江;陳元紅;陳將飛;劉佳明;廖軍華
• 申請（專利權）人: 溫州醫學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 張艷贊

技術領域

本發明屬于生物學技術領域，涉及一種斑馬魚胚胎DNA錯配修復功能活性的分析方法，以及此分析方法在環境化合物DNA錯配修復功能毒性評價上的應用。

背景技術

DNA錯配修復(mismatch?repair，MMR)系統廣泛存在于生物體中，它是DNA復制后的一種修復方式。其功能是修復DNA在復制過程中引入的錯配、插入或缺失突變，使DNA序列恢復正常。因此，它起著增強DNA復制保真度、修復DNA錯配、降低基因變異和維持基因組穩定性的作用。DNA錯配修復功能一旦減弱或缺失，機體非常容易產生突變，進而誘發突變表型產生癌變。因此，定量分析DNA?MMR功能活性是預防癌癥、進行藥物癌癥風險評價的一種重要手段。

目前，分析DNA錯配修復功能活性的方法有很多，主要有以噬菌體M13mp2及其衍生株為材料，通過噬菌斑變化來定量的方法；有以人工合成寡聚核苷酸為材料，通過限制性內切酶位點變化來定量的方法；有以EGFP基因作為報告基因，通過相對綠色熒光蛋白變化來定量的方法。前兩種方法以細胞核提取物來進行MMR功能活性評價，屬于體外分析法，存在操作過程復雜，指示參數靈敏度低和準確度低及不易統計等缺點。后一種方法是由美國德州大學孫魯浙(Lu?zhe-Sun)教授首次提出(Lei，X.；Zhu，Y.；Tomkinson，A.；Sun，L.，Measurement?of?DNA?mismatch?repair?activity?in?live?cells.Nucleic?Acids?Res?2004，32，(12)，e100.)，并經過一些優化與改進(Zhou，B.；Huang，C.；Yang，J.；Lu，J.；Dong，Q.；Sun，L.Z.，Preparation?of?heteroduplex?enhanced?green?fluorescent?protein?plasmid?for?in?vivo?mismatch?repair?activity?assay.Anal?Biochem?2009，388，(1)，167-9.Zhou，B.；Dong，Q.；Ma，R.；Chen，Y.；Yang，J.；Sun，L.Z.；Huang，C.，Rapid?isolation?of?highly?pure?single-stranded?DNA?from?phagemids.Anal?Biochem2009，389，(2)，177-9.中國專利申請號：201010586301.9，一種雙熒光質粒、基于其的活細胞內DNA錯配修復功能活性的分析方法及其應用)，在操作過程與精度方面較之于前兩種方法有了很大的進步，但是這三種方法對DNA?MMR功能活性的定量均只限于在細胞水平上，很難準確真實的反映生物體內MMR功能活性的強弱變化。因此，建立一種用于機體水平上進行DNA?MMR功能活性分析的方法，并將其用于環境化合物或藥物的致癌風險評價具有十分重大的現實意義。

斑馬魚是一種熱帶淡水魚，最初被用于發育生物學和遺傳學研究。由于斑馬魚有著獨特的優勢特征：體型小、易飼養繁殖、體外受精、卵生且產卵量大、胚胎透明、胚胎發育快、性成熟期短、與人類基因高度同源、污染物和藥物可以直接加入胚胎培養液中，斑馬魚現已成為研究大分子物質生物活性的一種重要動物模型。

隨著綠色熒光蛋白(Green?Fluorescent?Protein，GFP)轉基因技術成功的在斑馬魚模型上的應用，使用斑馬魚模型，尤其是綠色熒光蛋白轉基因斑馬魚胚胎模型來定性定量研究體內大分子物質的生物活性成為了一種可能。與其他動物模型相比，轉基因斑馬魚胚胎模型有著經濟、快速、方便及高效等優勢。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的是提供一種操作簡單、直觀有效度量的斑馬魚胚胎DNA錯配修復功能活性的分析方法以及此方法在評價環境化合物DNA錯配修復功能毒性上的應用，以克服傳統DNA錯配修復功能活性分析方法僅局限于細胞內，不能真實、準確地反映整體水平上DNA錯配修復功能活性的不足。

為達到上述目的，本發明采用如下技術方案：

本發明提供一種斑馬魚胚胎DNA錯配修復功能活性的分析方法，所述分析方法包括以下步驟：

1)以質粒pGEM-EGFP制備單鏈DNA分子，所述質粒pGEM-EGFP能正常表達綠色熒光蛋白；