[發明專利]一種斑馬魚胚胎DNA錯配修復功能活性的分析方法及其應用

無效

• 申請號: 201110343124.6
• 申請日: 2011-11-03
• 公開（公告）號: CN102392073A
• 公開（公告）日: 2012-03-28
• 發明（設計）人: 董巧香;黃長江;陳元紅;陳將飛;劉佳明;廖軍華
• 申請（專利權）人: 溫州醫學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 張艷贊

1.一種斑馬魚胚胎DNA錯配修復功能活性的分析方法，其特征在于，所述分析方法包括以下步驟：

1)以質粒pGEM-EGFP制備單鏈DNA分子，所述質粒pGEM-EGFP能正常表達綠色熒光蛋白；

2)用步驟1)中獲取的單鏈DNA分子同線性化的質粒pGEM-EGFP以及pGEM-(mt)EGFP分別制備同源和異源雙鏈核酸分子，其中所述質粒pGEM-(mt)EGFP的綠色熒光蛋白基因內第58個三聯密碼子處存在一無義突變，不能正常表達綠色熒光蛋白；

3)將制備好的同源和異源雙鏈核酸分子分別顯微注射至1-細胞期的斑馬魚胚胎中；

4)對胚胎DNA錯配修復功能活性進行定量。

2.根據權利要求1所述的分析方法，其特征在于，步驟1)包括：以轉化質粒pGEM-EGFP的大腸桿菌為材料，使用輔助噬菌體M13KO7，通過侵染的方法獲取單鏈DNA分子。

3.根據權利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述步驟1)包括：以質粒pGEM-EGFP為材料，使用缺刻酶Nb.Bsrd?I或Nb.Bpu10I形成帶缺刻的開環質粒，然后使用核酸外切酶III進行消化反應獲得單鏈DNA分子。

4.根據權利要求1所述的分析方法，其特征在于，步驟2)包括：將單鏈DNA分子同經限制性內切酶BstX?I或Mlu?I線性化的質粒pGEM-EGFP以及pGEM-(mt)EGFP分別進行退火，退火后產物經質粒安全性酶PSAD消化，去除殘留的單鏈DNA分子和線性化的質粒即可獲得高純的同源和異源雙鏈核酸分子。

5.根據權利要求1所述的分析方法，其特征在于，步驟2)中所述質粒pGEM-EGFP以及pGEM-(mt)EGFP在堿基組成上只有一個堿基的差別。

6.根據權利要求1所述的分析方法，其特征在于，步驟2)中所述異源雙鏈核酸分子中EGFP基因內第58個三聯密碼子處存在一G/T錯配。

7.根據權利要求1所述的分析方法，其特征在于，步驟3)包括：對胚胎分別注射30～100ng/μL的同、異源雙鏈核酸分子，且同、異源雙鏈核酸分子注射量相等，注射部位為細胞質或卵黃囊，每枚胚胎為500pL，指示劑酚紅濃度控制在0.025-0.050％，每個品系同源組和異源組注射同等數量的胚胎：≥100枚。

8.根據權利要求1所述的分析方法，其特征在于，步驟4)包括：注射胚胎12-36h后觀察并拍照，用軟件分析胚胎綠色熒光表達強度，并統計所注射胚胎綠色熒光表達率，胚胎DNA錯配修復功能活性以該品系的相對綠色熒光蛋白表達率來表示；所述相對綠色熒光蛋白表達率按以下公式計算獲得：

相對綠色熒光蛋白表達率＝異源組熒光表達率×異源組平均熒光強度/同源組熒光表達率×同源組平均熒光強度。

9.根據權利要求1-8中任一所述的分析方法，其特征在于，所述質粒pGEM-EGFP是通過將CMV-EGFP-PolyA片段從質粒pEGFP-N1酶切下來，然后利用T4連接酶連入載體pGEM5Zf(+)中而獲得。

10.權利要求1所述的分析方法在環境化合物DNA錯配修復功能毒性評價中的應用。