[發明專利]單核細胞增多性李斯特菌的肽核酸原位熒光鑒定方法及PNA探針

無效

• 申請號: 201110333423.1
• 申請日: 2011-10-28
• 公開（公告）號: CN102358908A
• 公開（公告）日: 2012-02-22
• 發明（設計）人: 張曉峰;吳姍;帥江冰;李可;董強
• 申請（專利權）人: 浙江省檢驗檢疫科學技術研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 杭州豐禾專利事務所有限公司 33214
• 代理人: 王從友

技術領域

本發明涉及用于鑒定單核細胞增多性李斯特菌（Listeria?monocytogenes）的PNA探針的設計，及應用PNA-FISH法鑒定單核細胞增多性李斯特菌的方法。

背景技術

李斯特菌屬包括單核細胞增多性李斯特菌（Listeria?monocytogenes）、伊氏李斯特菌（Listeria?ivanovii）、無害李斯特菌（L.?innocua），格氏李斯特菌（L.?grayi）、塞氏李斯特菌（L.?seeligeri）、威氏李斯特菌（L.?welsshimeri）、以及2009年新近發現的L.?marthii和L.?rocourtiae。其中單增李斯特菌和伊氏李斯特菌對動物具有致病性，且單增李斯特菌為人畜共患食源性致病菌。孕婦、小孩、老年人及免疫力低下人群易感，常表現為腦膜腦炎、腦炎、骨髓炎、心肌炎、膿血癥、流產等，發病率雖然不高，但死亡率較高，成年人的致死率為20%～60%，對嬰兒及免疫力低下的人群致死率高達54%～90%。該菌在自然界中廣泛分布，環境適應性很強，pH4.4～9.2、3～45℃以及高達10%NaCl的環境中均可以生長，通過多種途徑進入食品加工和生產過程污染食品，對消費者健康構成潛在威脅。

肽核酸是1991年由丹麥科學家Nielsen等人設計的一種以中性酰胺鍵為骨架的全新的DNA模擬物，其骨架結構單元為（2-氨乙基）甘氨酸，堿基部分通過亞甲基羰基連接與主骨架的氨基N上，可以序列特異地與DNA、RNA結合。其骨架為電中性，與DNA-DNA或RNA-DNA互補鏈相比，PNA-DNA和PNA-RNA互補不存在靜電排斥作用，因此具有很高的DNA或RNA親和性，在無錯配的情況下其結合具有高穩定性，且雜交速度快，具有良好的細胞穿透性，是核酸探針的良好選擇。同時PNA探針結合原位熒光雜交技術（FISH），與傳統生化鑒定比較，PNA-FISH法可節約大量時間，若不計增菌時間，一般耗時不超過4個小時。與PCR等方法比較，PNA-FISH法的結果判斷基于熒光檢測和形態檢測兩部分，較PCR法等假陽性較低，且PNA-FISH法可省去核酸提取的步驟。

發明內容

本發明的第一個目的是設計了單核細胞增多性李斯特菌的肽核酸原位熒光鑒定用PNA探針，該PNA探針具單核細胞增多性李斯特菌特異性；本發明的第二個目的是提供了一種單核細胞增多性李斯特菌的肽核酸原位熒光鑒定方法，該方法結合FISH檢測技術，實現對單核細胞增多性李斯特菌的快速檢測。

為了實現上述第一個目的，本發明采用以下技術方案：

單核細胞增多性李斯特菌的肽核酸原位熒光鑒定用PNA探針，其特征在于：該PNA探針的DNA序列如SEQ?ID?NO：1所示。

為了實現上述第二個目的，本發明采用以下技術方案：

單核細胞增多性李斯特菌的肽核酸原位熒光鑒定方法，該方法包括以下的步驟：

1）離心收集對數生長期的細菌，用PBS洗滌一次，再用PBS調整菌液濃度至OD₆₀₀=0.5-2.0；

2）取10μl?菌液于98%酒精清洗過的玻片上涂勻，火焰固定，將玻片于80%的酒精中浸泡15分鐘，風干；

3）25μl含500pmole/mlPNA探針的雜交緩沖液，PNA探針的DNA序列如SEQ?ID?NO：1所示，滴加于玻片上，55℃作用1-1.5小時，雜交后玻片于55℃預熱的洗滌緩沖液中洗滌2次，每次10分鐘；

4）取2～5μl菌液涂片，風干后顯微鏡觀察其熒光亮度及細菌的形態。

作為優選，上述的雜交緩沖液，pH7.5，該雜交緩沖液包括10%（w/v）硫酸葡聚糖，10?mM?NaCl，30%?(v/v)甲酰胺，0.1%（w/v）焦磷酸鈉，0.2%（w/v）聚乙烯吡咯烷酮，0.2%（w/v）聚蔗糖，5?mM?Na₂EDTA，0.2%?(v/v)?TritonX-100和50?mM?Tris/HCl。

作為優選，上述的洗滌緩沖液，pH10，該洗滌緩沖液包括5?mM?Tris，15mM?NaCl和0.1%?(v/v)?TritonX-100。