[發(fā)明專(zhuān)利]單核細(xì)胞增多性李斯特菌的肽核酸原位熒光鑒定方法及PNA探針

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110333423.1
• 申請(qǐng)日: 2011-10-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102358908A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-02-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張曉峰;吳姍;帥江冰;李可;董強(qiáng)
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 杭州豐禾專(zhuān)利事務(wù)所有限公司 33214
• 代理人: 王從友

1.單核細(xì)胞增多性李斯特菌（Listeria?monocytogenes）的肽核酸原位熒光鑒定用PNA探針，其特征在于：該P(yáng)NA探針的DNA序列如SEQ?ID?NO：1所示。

2.單核細(xì)胞增多性李斯特菌的肽核酸原位熒光鑒定方法，其特征在于該方法包括以下的步驟：

1）離心收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌，用PBS洗滌一次，再用PBS調(diào)整菌液濃度至OD₆₀₀=0.5-2.0；

2）取10μl?菌液于98%酒精清洗過(guò)的玻片上涂勻，火焰固定，將玻片于80%的酒精中浸泡15分鐘，風(fēng)干；

3）25μl含500pmole/mlPNA探針的雜交緩沖液，PNA探針的DNA序列如SEQ?ID?NO：1所示，滴加于玻片上，55℃作用1-1.5小時(shí)，雜交后玻片于55℃預(yù)熱的洗滌緩沖液中洗滌2次，每次10分鐘；

4）取2～5μl菌液涂片，風(fēng)干后顯微鏡觀察其熒光亮度及細(xì)菌的形態(tài)。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的單核細(xì)胞增多性李斯特菌的肽核酸原位熒光鑒定方法，其特征在于：雜交緩沖液，pH7.5，該雜交緩沖液包括10%（w/v）硫酸葡聚糖，10?mM?NaCl，30%?(v/v)甲酰胺，0.1%（w/v）焦磷酸鈉，0.2%（w/v）聚乙烯吡咯烷酮，0.2%（w/v）聚蔗糖，5?mM?Na₂EDTA，0.2%?(v/v)?TritonX-100和50?mM?Tris/HCl。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的單核細(xì)胞增多性李斯特菌的肽核酸原位熒光鑒定方法，其特征在于：洗滌緩沖液，pH10，該洗滌緩沖液包括5?mM?Tris，15mM?NaCl和0.1%?(v/v)?TritonX-100。