[發(fā)明專利]固氮斯氏假單胞菌A1501 rpoN基因的表達(dá)方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110326704.4
• 申請日: 2011-10-25
• 公開（公告）號: CN102417882A
• 公開（公告）日: 2012-04-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉國憲;李軼女;張志芳;沈桂芳;程奇
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所
• 主分類號: C12N1/13
• 分類號: C12N1/13;C12N15/79;C12R1/38;C12R1/89
• 代理公司: 北京市德權(quán)律師事務(wù)所 11302
• 代理人: 余光軍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及固氮斯氏假單胞菌(Pseudomonas?stutzeri)A1501的rpoN基因的表達(dá)方法，尤其涉及利用衣藻葉綠體表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)斯氏假單胞菌Pseudomonas?stutzeri?A1501的rpoN基因的方法，屬于固氮斯氏假單胞菌A1501?rpoN基因的表達(dá)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

氮是構(gòu)成蛋白質(zhì)和核酸的主要物質(zhì)，是自然界中動物、植物、微生物不可缺少的生命元素。氮素在自然界有多種存在形式，數(shù)量最大的是大氣中的氮?dú)庹即髿怏w積的79％，總量約3.9×107億噸，但是不能為大多數(shù)生物(包括所有植物和動物)直接利用，因此氨態(tài)氮的供應(yīng)成為生物界繁榮發(fā)展的主要決定因素。目前，固氮主要有以下兩種方式，即工業(yè)固氮和生物固氮。工業(yè)固氮指用高溫、高壓、化學(xué)催化的方法；生物固氮是指某些種類的原核生物利用體內(nèi)的固氮酶將空氣中的氮?dú)膺€原為氨，為植物生長提供氮素。

人類對于生物固氮的認(rèn)識要追溯到十九世紀(jì)，距今已有100多年的歷史。最早在1830年，Boussingault報(bào)道豆科植物可以固氮。Hellriegel?&?Wilfarth于1886年報(bào)道并于1888年發(fā)表關(guān)于豆科植物能夠固氮的可靠依據(jù)，并且確定了豆科植物的根瘤是固氮的主要場所。隨后不久，厭氧的Clostridium?pasteurianum，好養(yǎng)的Azotobacter?chroococcum，以及cyanobacteria，photosynthetic?bacteria，Klebsiella?spp.，Archaebacteria，Desulfovibrio?sp.，等都加入到固氮的行列。到目前為止，隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)自然界中可進(jìn)行生物固氮的微生物種屬范圍分布比較廣，可以分成自生固氮、共生固氮和聯(lián)合共生固氮3種。

生物固氮主要依靠多數(shù)原核生物，這些原核生物之所以能夠固氮，是因?yàn)楣痰傅木壒?。固氮酶是一種復(fù)雜的金屬酶，由鉬鐵蛋白和鐵蛋白組成(或稱為組分I和組分II，也有稱之為Dinitrogenase和Dinitrogenase?reductant)。固氮作用是一個復(fù)雜的過程，其調(diào)節(jié)是在轉(zhuǎn)錄水平上實(shí)現(xiàn)的，主要是根據(jù)環(huán)境中氧氣的含量和銨的水平進(jìn)行調(diào)控的。

固氮斯氏假單胞菌(Pseudomonas?stutzeri)A1501的rpoN基因在斯氏假單胞菌A1501的固氮調(diào)節(jié)作用中起著非常重要的作用。RNA聚合酶需要依靠σ⁵⁴(rpoN基因的產(chǎn)物)才能啟動主要nif基因簇的轉(zhuǎn)錄，因此才能保證某些原核生物的固氮作用。

為了深入的研究固氮斯氏假單胞菌的固氮作用機(jī)理以及rpoN蛋白的功能、特性及純化方式等，需要有大量的rpoN蛋白作為物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，提供一種穩(wěn)定、高效的表達(dá)rpoN基因的方法能夠?yàn)楣痰故霞賳伟墓痰{(diào)節(jié)作用機(jī)制以及rpoN蛋白的功能、特性及純化方式等研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種固氮斯氏假單胞菌A1501的rpoN基因的表達(dá)方法，該方法以衣藻葉綠體為表達(dá)系統(tǒng)，能夠穩(wěn)定、高效的在衣藻葉綠體中表達(dá)rpoN基因。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

固氮斯氏假單胞菌(Pseudomonas?stutzeri)A1501的rpoN基因的表達(dá)方法，包括：構(gòu)建rpoN基因的表達(dá)盒；將所構(gòu)建的rpoN基因的表達(dá)盒插入到衣藻葉綠體表達(dá)載體上的衣藻葉綠體基因組的同源片段之間，構(gòu)建得到重組衣藻葉綠體表達(dá)載體；將重組衣藻葉綠體表達(dá)載體轉(zhuǎn)化衣藻；篩選轉(zhuǎn)基因衣藻，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因衣藻中的rpoN基因表達(dá)，收獲并純化所表達(dá)的蛋白。

其中，所述的斯氏假單胞菌Pseudomonas?stutzeri?A1501的rpoN基因的核苷酸序列為SEQ?ID?NO：1所示；

所述的rpoN基因的表達(dá)盒由衣藻葉綠體特異啟動子、rpoN基因和衣藻葉綠體特異終止子所組成，其中，rpoN基因置于衣藻葉綠體基因特異啟動子和終止子的調(diào)控之下；所述的衣藻葉綠體特異啟動子包括但不限于atpA、atpB、psbA、psbD或rbcL，優(yōu)選為atpA啟動子；所述的衣藻葉綠體特異終止子優(yōu)選為rbcL終止子。

所述的衣藻葉綠體基因組的同源片段為trnE2-psbH基因，其核苷酸序列為SEQ?ID?NO：2所示；