[發明專利]青藏高原野生大麥HsCIPK26基因

無效

• 申請號: 201110321518.1
• 申請日: 2011-10-21
• 公開（公告）號: CN102399799A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發明（設計）人: 潘建偉;王文祥;鄭仲仲;沈金秋;查笑君
• 申請（專利權）人: 浙江師范大學
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N9/12
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及涉及基因工程技術領域，尤其是一種青藏高原野生大麥HsCIPK26基因。

背景技術

目前，在已完成基因組測序工作的植物中，相關學者已從擬南芥中鑒定出26個AtCIPKs，31個水稻OsCIPKs，43個玉米ZmCIPKs，27個胡楊PtCIPKs，其他如棉花、番茄、葡萄、高粱等物種中也有相繼報道。根據已有的研究結果，植物CIPK主要參與各種逆境脅迫的信號傳導。由于目前大麥基因組測序仍未完成，無法確定其含有多少個HsCIPK基因，但理論上野生大麥基因組中至少應包含31個HsCIPKs基因家族成員。從基因結構上來看，AtCIPK基因分為多內含子基因和少內含子基因，通過轉錄表達和功能分析表明，CIPK基因是否含有內含子與其對應的逆境脅迫沒有明顯關系。已有研究表明CBL與CIPK之間并不是簡單的一對一關系，一個CBL可以與多個CIPK相結合，多個CBL也可以和一個CIPK互作，一種脅迫可能引起多種CBL-CIPK互作。已有的研究證明，AtCIPK14基因可能參與糖信號調節途徑，OsCIPK2、OsCIPK10、OsCIPK11和OsCIPK14基因在高鹽、低溫等逆境下表達量都有不同程度的變化，可能參與了多條逆境信號轉導途徑。

表達序列標簽(expressed?sequence?tags，EST)是對某個基因cDNA克隆測序所得的部分序列片段，長度大約為200-600bp由于基因表達調控作用不同，同一個基因的mRNA剪接位點和方式不同，所以同一個基因的全長cDNA可能包含多個EST。EST既代表了基因cDNA的某一區段，也表征了成熟mRNA可能的剪接方式。電子克隆技術是生物學數據庫中EST數據庫、核酸序列數據庫、基因組數據庫，采用同源性序列比對和歸類分析、重疊區域組裝和拼接等方法延長EST序列，直至沒有與之同源的序列可供拼接為止，所得到的序列可以認為是相對應基因的全長cDNA，根據所得的cDNA序列設計囊括開放閱讀框兩端的引物，進行RT-PCR克隆出相應基因的方法。

轉座子標簽法，DNA亞克隆，電子克隆(Cloning?In?Silico)，Tail-PCR，iPCR(Inverse?PCR)，TD-PCR(Touchdown-PCR)，RACE(cRACE、3’-RACE、5’-RACE)等技術都是分子克隆中常用的技術。此外隨著轉座子的深入研究及測序技術的飛躍發展，直接分離鑒定新基因的難度變得越來越小。

發明內容

本發明利用水稻OsCIPK同源基因序列設計電子探針，從已有的各種大麥核苷酸序列庫如EST庫中搜索同源片段，然后用聚類分析和電子拼接等方法，獲取目標基因編碼序列(coding?sequence，CDS)。運用生物信息學方法對目標基因進行結構分析和功能預測。提取野生大麥總RNA，制備cDNA和設計PCR引物，通過PCR技術克隆目標基因。對所獲得的目標基因進行TA克隆、測序和序列分析。

青藏高原野生大麥HsCIPK26基因，源于青藏高原一年生野生大麥且它是植物所特有、與CBL特異作用的一類絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，其由SEQ?ID?NO：1的核苷酸序列定義。

所述的青藏高原野生大麥HsCIPK26基因，它在N端有一特異的催化結構域，C端區域含有一個獨特的21-24個氨基酸組成的調節域即NAF結構域，這兩個調節域的序列在所有CIPK中高度保守，，所述的青藏高原野生大麥HsCIPK26基因，其編碼SEQ?ID?NO：2定義的氨基酸序列

本發明從青藏高原一年生野生大麥(Hordeum?spontoneum?C.Koch)中鑒定并分離出HsCIPK26基因。

附圖說明

圖1為HsCIPK26電泳結果；

圖2為pMD18T::HsCIPK26陽性克隆鑒定結果；

圖3為青藏高原一年生野生大麥HsCIPK26基因的蛋白結構；

圖4為青藏高原一年生野生大麥HsCIPK26基因的全序列；

圖5本發明技術路線圖；

圖6為本鹽誘導HsCIPK26基因的Real-time?PCR圖。

具體實施方式

以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。

實施例1HsCIPK26基因全序列的獲得

1.1引物設計(帶下劃線的為酶切位點序列)：

HsCIPK26-KpnI-F：CGGGGTACCATGGAAGACAGGAGTGTTTTGACCAAAC