[發明專利]啤酒花潛隱類病毒的實時熒光RT-PCR檢測試劑及檢測方法

有效

• 申請號: 201110319087.5
• 申請日: 2011-10-20
• 公開（公告）號: CN102382903A
• 公開（公告）日: 2012-03-21
• 發明（設計）人: 郭立新;段維軍;聞偉剛
• 申請（專利權）人: 中華人民共和國北侖出入境檢驗檢疫局;寧波檢驗檢疫科學技術研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/94
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理事務所(普通合伙) 33226
• 代理人: 程曉明

技術領域

本發明涉及類病毒的檢測技術，具體涉及涉及啤酒花潛隱類病毒的實時熒光RT-PCR檢測試劑及檢測方法。

背景技術

啤酒花潛隱類病毒（Hop?latent?viroid，HpLVd）隸屬于Cocadviroid屬，分布于英國、德國、韓國、波蘭、日本、捷克、巴西、美國、中國新疆等國家和地區的啤酒花上。該類病毒侵染啤酒花后一般不表現明顯的癥狀，但會改變其一些次生代謝產物成分，從而影響啤酒花品質，降低啤酒花產量。Adams等報道，不同啤酒花品種受HpLVd侵染后，a-酸的含量降低20%～50%；受HpLVd侵染的啤酒花球果產量降低11%。

目前國內外檢測啤酒花潛隱類病毒的方法主要是分子雜交法；分子雜交法的前提是要制備探針，較為復雜，且檢測步驟繁瑣。近年來，利用TaqMan-MGB探針進行實時熒光RT-PCR反應是在常規RT-PCR反應體系中添加了1條TaqMan-MGB探針；探針的5'端含有報告熒光基團，3'端含有不發熒光的淬滅基團并具有MGB分子。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收，進行PCR擴增時，TaqDNA聚合酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，發出熒光信號，從而使熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。目前實時熒光PCR技術已廣泛用于病毒檢測、細菌檢測、植原體檢測、轉基因產品檢測、線蟲檢測等諸多領域，但對啤酒花潛隱類病毒的實時熒光RT-PCR檢測尚未見公開報道。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種操作簡單、快速、靈敏、準確的檢測啤酒花潛隱類病毒的檢測試劑及方法。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案之一是提供一種檢測啤酒花潛隱類病毒的實時熒光RT-PCR檢測試劑，包含一對特異性引物和一條特異性熒光探針，擴增目標片段長度為61bp，引物和探針序列為：

引物HLV-F：?5'-CGTGGAACGG?CTCCTTCTT-3'；

引物HLV-R：5'-AGAGTTGTAT?CCACCGGGTA?GTTT-3'；

探針HLV-P：5'-CACCAGCCGG?AGTT-3'，該探針的5'端含有FAM報告熒光染料，3'端含有不發熒光的淬滅基團并具有MGB分子；擴增目標片段的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：4所示。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案之二是提供一種能簡單、快速、靈敏、準確地檢測啤酒花潛隱類病毒的方法，是以啤酒花樣品總RNA為模板，用上述檢測啤酒花潛隱類病毒的引物和探針進行實時熒光RT-PCR，檢測擴增產物熒光信號；

所述啤酒花樣品可為啤酒花幼苗、葉片和球果；

上述方法中，如從擴增產物中可檢測到熒光信號，說明所述檢測樣品含有啤酒花潛隱類病毒，而且可以根據Ct（循環閾值）的大小確定樣品中的起始模板的量；

所述啤酒花樣品經RNA提取試劑盒（購自Qiagen公司）提取植物總RNA，得到總RNA模板，具體操作見試劑盒說明書；

所述實時熒光RT-PCR反應是以提取樣品總RNA為模板，25μL反應體系中Mg²⁺終濃度為5.5mM、引物HLV-F和HLV-R的終濃度都為0.7μM、探針HLV-P終濃度為0.5μM、2xQuantiTect?Probe?RT-PCR?Master?Mix（含終濃度4.0?mM的Mg²⁺、購自Qiagen公司）為12.5?μL、QuantiTect?RT?Mix（購自Qiagen公司）為0.25μL，RNA（20?ng/μL~200?ng/μL）為1μL，RNase?Free?dH₂O補至25μL；所述實時熒光RT-PCR的反應條件為：50℃?30?min；95℃?15?min；然后94℃?15?s，60℃?60?s，共40個循環。反應體系也可以為50μL等。?

本發明針對現有啤酒花潛隱類病毒檢測方法費時、繁瑣等缺點，提供了一種操作簡單、快速、靈敏、準確的檢測啤酒花潛隱類病毒的實時熒光RT-PCR檢測方法。本發明方法中實時熒光RT-PCR檢測試劑的專用引物和探針對啤酒花潛隱類病毒具有很強的專化性，并通過對反應體系的優化，不僅能提高啤酒花潛隱類病毒檢測的效果，還能對受檢樣品進行定量分析。