[發(fā)明專利]一種石鰈肝臟細胞系的構(gòu)建方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110316881.4
• 申請日: 2011-10-19
• 公開（公告）號: CN102321569A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 魏云波;劉書花;張瑞凌;李福偉;王興民;徐建榮
• 申請（專利權(quán)）人: 山東省分析測試中心
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 濟南舜源專利事務(wù)所有限公司 37205
• 代理人: 曲志波

技術(shù)領(lǐng)域

????本發(fā)明涉及一種利用石鰈肝臟組織細胞建立肝臟細胞系的方法——石鰈肝臟細胞系的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

石鰈（Kareius?bicoloratus）是溫熱帶海洋底棲魚類，盛產(chǎn)于我國的黃海、渤海，是我國重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟魚類。頻繁爆發(fā)的各種病毒性疾病對石鰈養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴重的影響，造成患病石鰈大面積死亡，經(jīng)濟損失嚴重，并可能通過食物鏈威脅到人類健康。目前尚無適當?shù)乃幬锘蛞呙缈蛇M行有效防治，亟待開發(fā)和生產(chǎn)安全高效的無公害漁藥。其中，將抗病毒譜廣、毒副作用小的各種中草藥有效成分應(yīng)用于疾病防治，可以解決使用化學藥物造成的耐藥性和藥物殘留超標等問題，符合國際上食用性動物藥品的“低毒、無殘留、高藥效”的發(fā)展要求。因此，為了研究石鰈病毒傳播機制、宿主細胞的防御機制及病毒與宿主之間的相互作用機理，并進行中草藥有效成分抗病毒機理研究，利用病毒易于感染的石鰈肝臟組織，建立石鰈肝臟連續(xù)性細胞系是十分必要的。

魚類肝臟組織含有較多的膠原和纖維組織，現(xiàn)有專利中的魚類細胞系構(gòu)建方法中，快速剪碎組織時產(chǎn)生的機械剪切力，會對肝臟細胞產(chǎn)生很大影響，不能使肝臟原代細胞正常貼壁并增殖，所提供的各種酶消化法處理后，肝臟組織塊中細胞遷出數(shù)量少，消化后的細胞數(shù)量少，不易貼壁，且魚類肝臟組織不同于哺乳動物肝臟，無法使用目前構(gòu)建哺乳動物肝臟細胞系常用的灌注消化法進行細胞系建立。因此，需要研究一種有效的石鰈肝臟細胞系的構(gòu)建方法，以建立石鰈肝臟細胞系，為在分子細胞水平上研究多種中草藥有效成分的抗病毒作用機理，從而研制出病害防治中的有效治療藥物或免疫增強劑，解決日益嚴重的各種水產(chǎn)養(yǎng)殖病害。

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發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是利用石鰈肝臟組織，針對肝臟組織特點，提供一種石鰈肝臟細胞系的構(gòu)建技術(shù)，以彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足。

本發(fā)明的構(gòu)建方法：首先對鮮活石鰈用75%酒精消毒處理，用紗布擦除體表粘液，置于超凈工作臺中解剖取下肝臟組織，磷酸鹽緩沖液漂洗后粗剪成約50-100?立方毫米的組織塊。根據(jù)肝臟組織特點，設(shè)定兩次酶消化處理。首先在消化液I（含0.1%-0.2%的胰蛋白酶和0.1%-0.2%EDTA的磷酸鹽緩沖液）中對處理好的肝臟組織塊消化5-10分鐘，用血清中和反應(yīng)后，離心收集肝臟組織塊；再在消化液II（0.1%-0.2%Ⅳ型膠原酶的DMEM/F12培養(yǎng)液）中進行第二次酶消化處理，首先用滴管緩慢吹打組織塊，使其混合均勻，靜置消化0.5小時后將上部懸液取出；再加入新的消化液II，慢速將肝臟組織塊繼續(xù)剪至小于1?立方毫米（約0.5-1小時）后，繼續(xù)消化1小時，消化完畢后，混合所得細胞懸液，經(jīng)200目鋼網(wǎng)過濾，離心收集后，用含有5%胎牛血清、1‰-2‰比例的硫酸軟骨素和1‰-2‰比例的N-乙酰葡萄糖鹽酸鹽的pH值為7.0-7.4的DMEM/F12培養(yǎng)液充分懸浮，均勻接種于已用0.1%明膠預(yù)先鋪板的24孔細胞培養(yǎng)板中，22-24℃下貼壁1小時后，每孔加入1mL石鰈肝臟細胞專用增殖培養(yǎng)液，置22-24℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天半量更換石鰈肝臟細胞專用增殖培養(yǎng)液一次，待石鰈肝臟細胞長滿培養(yǎng)孔后，將細胞懸浮、混合，轉(zhuǎn)至25毫升培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，每隔3-5天半量更換石鰈肝臟細胞專用增殖培養(yǎng)液一次；待細胞長成單層后，使用濃度為0.125%-0.25%胰蛋白酶溶液消化，按1瓶傳2瓶的方式進行傳代培養(yǎng)；所述的石鰈肝臟細胞專用增殖培養(yǎng)液配方為含有20%胎牛血清、1‰-2‰比例的硫酸軟骨素和1‰-2‰比例的N-乙酰葡萄糖鹽酸鹽、pH值為7.0-7.4的DMEM/F12培養(yǎng)液。為了促進石鰈肝臟細胞的分裂和快速增殖，本發(fā)明又添加了0.02‰-0.04‰的人肝細胞生長因子和10%-20%的已抽濾的石鰈肝臟抽提液。

本發(fā)明的有益效果是：針對石鰈肝臟組織特點，采用兩步酶消化法，避免原代培養(yǎng)中常規(guī)酶消化法及組織塊處理時機械剪切力對肝臟細胞造成的影響，獲得的原代肝臟細胞可以正常貼壁生長，并通過添加多種細胞外基質(zhì)成分及添加物，使肝臟細胞快速增殖，連續(xù)傳代并成功建系，經(jīng)這種方法所構(gòu)建的肝臟細胞系現(xiàn)已傳至第110代，細胞仍保持石鰈肝臟細胞的特性，該細胞系可在分子細胞水平上進行魚類病毒學研究并進行相關(guān)治療藥物的研制。

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具體實施方式

將上述本發(fā)明的方法按照細致步驟進行詳述如下：