[發(fā)明專利]一種石鰈肝臟細(xì)胞系的構(gòu)建方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110316881.4
• 申請(qǐng)日: 2011-10-19
• 公開（公告）號(hào): CN102321569A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 魏云波;劉書花;張瑞凌;李福偉;王興民;徐建榮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東省分析測(cè)試中心
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071
• 代理公司: 濟(jì)南舜源專利事務(wù)所有限公司 37205
• 代理人: 曲志波

1.一種石鰈肝臟細(xì)胞系的構(gòu)建方法，其特征是它包括如下步驟：對(duì)鮮活石鰈用75%酒精消毒處理，用紗布擦除體表粘液，置于超凈工作臺(tái)中解剖取下肝臟組織，磷酸鹽緩沖液漂洗后粗剪成約50-100?立方毫米的組織塊；進(jìn)行兩步酶消化法后，混合所得細(xì)胞懸液；經(jīng)200目鋼網(wǎng)過濾，離心收集后，用含有5%胎牛血清、1‰-2‰比例的硫酸軟骨素和1‰-2‰比例的N-乙酰葡萄糖鹽酸鹽的DMEM/F12培養(yǎng)液充分懸浮，均勻接種于已用0.1%明膠預(yù)先鋪板的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，22-24℃下貼壁1小時(shí)，每孔再加入1mL石鰈肝臟細(xì)胞專用增殖培養(yǎng)液，置22-24℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天半量更換石鰈肝臟細(xì)胞專用增殖培養(yǎng)液一次，待石鰈肝臟細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)孔后，轉(zhuǎn)至25毫升培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，每隔3-5天半量更換石鰈肝臟細(xì)胞專用增殖培養(yǎng)液一次；待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，使用濃度為0.125%-0.25%胰蛋白酶溶液消化，按1瓶傳2瓶的方式進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并最終建立石鰈肝臟細(xì)胞系；所述石鰈肝臟細(xì)胞專用增殖培養(yǎng)液配方為含有20%胎牛血清、1‰-2‰比例的硫酸軟骨素和1‰-2‰比例的N-乙酰葡萄糖鹽酸鹽的DMEM/F12培養(yǎng)液pH值7.0-7.4。

2.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征是所述兩步酶消化法是指在消化液I中消化肝臟組織塊5-10分鐘，消化液I中含0.1%-0.2%的胰蛋白酶和0.1%-0.2%EDTA的磷酸鹽緩沖液，離心收集組織塊后再加入消化液II，消化液II是0.1%-0.2%Ⅳ型膠原酶的DMEM/F12培養(yǎng)液，混合均勻靜置消化0.5小時(shí)后將上部懸液取出；再加入新的消化液II，用0.5-1小時(shí)慢速將肝臟組織塊繼續(xù)剪至小于1?立方毫米后，繼續(xù)消化1小時(shí)，獲得所需的肝臟細(xì)胞。

3.如權(quán)利要求2所述的構(gòu)建方法，其特征是在上述石鰈肝臟細(xì)胞專用增殖培養(yǎng)液中添加了占上述專用增殖培養(yǎng)液0.02‰-0.04‰的人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和10%-20%的已抽濾的石鰈肝臟抽提液。