[發明專利]一種利用固定化擬無枝酸菌分段發酵無錫他汀的方法

無效

• 申請號: 201110316323.8
• 申請日: 2011-10-18
• 公開（公告）號: CN102373249A
• 公開（公告）日: 2012-03-14
• 發明（設計）人: 諸葛斌;曹艷輝;諸葛健;方慧英
• 申請（專利權）人: 江南大學;無錫天沁生物技術有限公司
• 主分類號: C12P17/06
• 分類號: C12P17/06;C12N11/10;C12N11/04;C12R1/01
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

技術領域：

本發明涉及利用固定化擬無枝酸菌分段發酵無錫他汀的方法，屬于發酵工程技術領域。

技術背景：

膽固醇含量升高是引起高血脂的主要原因，而人體膽固醇主要來自自身的合成。在膽固醇合成過程中，羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶使HMG-CoA轉變成甲基二羥戊酸，這是膽固醇生物合成中的限速步驟，在HMG-CoA還原酶抑制劑存在條件下，HMG-CoA還原酶受到抑制，無法正常發揮作用，膽固醇的生成過程受到干擾，從而達到降低血脂的目的。他汀類藥物屬于HMG-CoA還原酶抑制劑，為降脂藥物中的首選藥物。

無錫他汀由洛伐他汀經擬無枝酸菌轉化產生，是一種新型高效HMG-CoA還原酶抑制劑，抑制作用為洛伐他汀的4倍。中國發明專利公報2010年12月8日公開了一種提高無錫他汀產量的方法，專利申請號201010225950.6，專利公開號101906446A，該方法利用游離擬無枝酸菌分段發酵，通過兩階段pH控制，提高無錫他汀的產量。其缺點是游離擬無枝酸菌對底物洛伐他汀的耐受性較差，并且對發酵過程中的剪切力等條件較為敏感，這將大大影響分段發酵無錫他汀的產量。

發明內容：

本發明要解決的技術問題是提供一種利用固定化擬無枝酸菌分段發酵無錫他汀的方法，通過固定化提高擬無枝酸菌對底物洛伐他汀的耐受性以及對發酵條件的敏感度，并進一步提高無錫他汀產量的發酵工藝。

為解決上述技術問題，本發明的技術方案為：

將擬無枝酸菌(Amycolatopsis?sp.，保藏編號為CGMCC?NO.1149，在專利號為200410044893.6的專利申請中進行了保藏)進行固定化處理，利用固定化擬無枝酸菌分段發酵無錫他汀，提高擬無枝酸菌對底物洛伐他汀的耐受性，提高無錫他汀的產量，具有較好的操作穩定性，可重復利用。

所述擬無枝酸菌固定化方法為：將培養好的種子菌懸液與海藻酸鈉溶液按照2∶10的比例充分混勻，然后用注射器將其滴入CaCl₂溶液中，固定1h，濾出小珠，用蒸餾水洗凈，得到固定化細胞。

所述兩階段發酵控制條件為：發酵第一階段，固定化細胞經過48h增殖培養后，按1.0-3.0g/L的濃度加入洛伐他汀溶液，30℃發酵48h生成產物I，發酵pH為7.5；發酵第二階段，將第一階段發酵結束的固定化細胞洗凈，加入新鮮轉化培養基，按照0.1-0.3g/L的的濃度加入產物I溶液，30℃發酵10h生成無錫他汀，發酵pH為5.5。

所述擬無枝酸菌可用于多次發酵，用無菌去離子水將上一批發酵結束的固定化細胞沖洗三次，加入新鮮轉化培養基，進行下一批發酵，最適發酵批次為5批。

產物I的制備：pH?7.5的轉化培養基中加入底物洛伐他汀發酵48h，中間產物I大量生成，離心濃縮，以大孔吸附樹脂HP?20為柱填料，甲醇為洗脫劑進行梯度洗脫，收集60％～70％甲醇梯度富集的中間產物I的洗脫液，濃縮后微孔膜過濾除菌備用。

洛伐他汀、產物I以及無錫他汀含量的檢測方法：將發酵結束的發酵液離心，微膜過濾后利用HPLC檢測。

HPLC條件：色譜柱Kromasil?C18(5μm，250×4.6mm)；流動相??甲醇-0.5％乙酸(80∶20)；流速0.8mL/min；柱溫：25℃；進樣量20μL；檢測波長237nm。

本發明提出利用固定化擬無枝酸菌分段發酵無錫他汀的方法，通過對擬無枝酸菌進行固定化處理，并進行多批次分段發酵，將擬無枝酸菌對洛伐他汀的耐受濃度從1g/L提升到3g/L；將發酵液中產物I的濃度從0.55g/L提高到1.92g/L；使無錫他汀的產量從0.165g/L提高到0.225g/L，固定化細胞具有較好的操作穩定性，可重復利用。

具體實施方式

實施例1

1、固定化細胞制備

將擬無枝酸菌斜面接到種子培養基，28℃靜止培養48h。種子液通過兩層擦鏡紙過濾，將菌絲體過濾除掉，收集的濾液為孢子種子液。將獲得的種子液與20g/L海藻酸鈉溶液按照1mL菌懸液/5mL凝膠的比例充分混勻，然后用注射器將其滴入10g/L的CaCl₂溶液中，注射高度為10cm，固定1h，濾出小珠，用蒸餾水洗凈，得到粒徑為3mm左右的固定化細胞。