[發明專利]一種水生雙順反子病毒的RT-PCR檢測方法

無效

• 申請號: 201110315727.5
• 申請日: 2011-10-18
• 公開（公告）號: CN102329896A
• 公開（公告）日: 2012-01-25
• 發明（設計）人: 潘曉藝;沈錦玉;袁雪梅;藺凌云;郝貴杰;姚嘉赟;徐洋;尹文林
• 申請（專利權）人: 浙江省淡水水產研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所 33213
• 代理人: 吳秉中

技術領域

本發明屬于病毒檢測技術領域，具體涉及一種水生雙順反子病毒(Aquatic?dicistrovirus,?AQDV)的RT-PCR檢測方法。

發明內容

水生雙順反子病毒(Aquatic?dicistrovirus,?AQDV)是水生甲殼動物的重要病原，屬于雙順反子病毒科，現已發現三個未定種，包括造成對蝦套拉綜合癥的套拉綜合癥病毒（Taura?syndrome?virus,?TSV）、造成鋸緣青蟹“嗜睡癥”的鋸緣青蟹雙順反子病毒（Mud?crab?dicistrovirus，MCDV）和造成羅氏沼蝦幼體綜合癥的羅氏沼蝦雙順反子病毒（Macrobrachium?rosenbergii?dicistrovirus，MRDV）。而對蝦、青蟹和羅氏沼蝦都是我國甲殼類動物主要養殖品種，其中羅氏沼蝦養殖產量于2008年已成為全球第一。然而在以上三種病毒的困擾下，對蝦死亡率達90%以上，青蟹死亡率達80%以上，羅氏沼蝦死亡率達80%以上，這給我國對蝦、青蟹和羅氏沼蝦育苗及養殖產業造成巨大的經濟損失。

以上三種病毒除了TSV的易感宿主已比較明確外，MCDV和MRDV的敏感宿主還未進行研究，這就給疾病的預防，病原傳播途徑的切斷造成了困難。而在養殖業中及時監測水生雙順反子病毒的發病情況，尋找有效的預防和防治方法，是當前水生甲殼動物養殖需要解決的主要問題。

目前由于缺乏能同時檢測以上三種水生雙順反子病毒的檢測方法，這就給需要同時檢測以上三種病原造成麻煩。本發明研制的能同時檢測以上三種水生雙順反子病毒的RT-PCR方法和套式RT-PCR檢測方法，彌補了該技術領域的缺陷，為以上三種水生雙順反子病毒的同時監測提供有力手段。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明的目的在于設計提供一種水生雙順反子病毒的RT-PCR檢測方法的技術方案，該方法能同時檢測桃拉綜合癥病毒、鋸緣青蟹雙順反子病毒和羅氏沼蝦雙順反子病毒基因組。該方法直觀優越、敏感性好、特異性高，對檢測微量、保存時間久的標本中水生雙順反子病毒基因組的效果良好，可用于水生雙順反子病毒感染的實驗室檢測和水生雙順反子病毒的分子流行病學調查。

?所述的一種水生雙順反子病毒的RT-PCR檢測方法，其特征在于包括以下步驟：1）用水生雙順反子病毒特異性引物P0對待測RNA樣品進行逆轉錄得到cDNA第一鏈，cDNA用水生雙順反子病毒通用引物組P1/P0進行PCR擴增；2）上述得到的擴增產物用電泳鑒定；

所述的水生雙順反子病毒特異性引物P0為：5'-TACTCCACATRCACATATCTTC-3'；

所述的水生雙順反子病毒通用引物組P1/P0中：上游引物P1為5’-?GTKTATTCKTATGATTGGWC-3',下游引物P0為5’-TACTCCACATRCACATATCTTC-3'。

所述的一種水生雙順反子病毒的RT-PCR檢測方法，其特征在于所述的步驟1）中逆轉錄反應條件為：37℃反應60min，90℃?5min終止反應，置冰上冷卻5min，得到cDNA第一鏈。

所述的一種水生雙順反子病毒的RT-PCR檢測方法，其特征在于所述的步驟1）中PCR反應條件為：95℃預變性3min，94℃變性40s,?50℃復性40s，72℃延伸l?min，循環35次，最后72℃延伸10min。

所述的一種水生雙順反子病毒的RT-PCR檢測方法，其特征在于所述的步驟1）中當待測RNA樣品所含病毒RNA量過低而未檢出時，再以PCR擴增產物為模板，采用水生雙順反子病毒通用引物組P2/P3進行套式PCR；?

所述的水生雙順反子病毒通用引物組P2/P3中：上游引物P2為5’-?GRWGATGATGMRGARAATGGT-3',下游引物P3為5’-RAACCACTCACWMACYTTATC-3'。

所述的一種水生雙順反子病毒的RT-PCR檢測方法，其特征在于所述的套式PCR反應條件為：95℃預變性3min，94℃變性40s,?52℃復性40s，72℃延伸l?min，循環35次，最后72℃延伸10min。