[發明專利]一種草莓原生質體的提取及融合方法

有效

• 申請號: 201110315610.7
• 申請日: 2011-10-18
• 公開（公告）號: CN102505004A
• 公開（公告）日: 2012-06-20
• 發明（設計）人: 馮穎;顧地周;朱俊義;楊麗娟
• 申請（專利權）人: 通化師范學院
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12N15/05
• 代理公司: 通化旺維專利商標事務所有限公司 22205
• 代理人: 王偉

1.一種草莓原生質體的提取及融合方法，其特征在于步驟如下：

(1)分別取綠葉東方草莓和盧比草莓試管苗移入MS培養基培養10天，或者暗培養一周；MS培養基為6-芐基腺嘌呤(6-BA)1.0-1.5mg/L，蔗糖1-1.5％和瓊脂0.7％；

(2)取步驟(1)預處理的葉片剪成細條并去除葉脈；

(3)將材料與酶液按照1∶10體積比混合，用Parafilm封口，錫箔紙密封，置于搖床上在26℃恒溫、速度60r/min條件下進行暗酶解，時間11-14h，并定時鏡下觀察酶解情況；酶液組成為1.0-2.0％纖維素酶Cellulase?OnozukaR-10+0.5-1.0％果膠酶Pectolyase?Y-23+0.6mol/L的甘露醇+0.1-0.2％2-(N-嗎啡啉)乙磺酸MES+0.05mol/L的CaCl₂的組合；

(4)分別將酶解完全的綠葉東方草莓和盧比草莓的葉肉原生質體懸浮液經200目尼龍紗網過濾后，離心、去上清液，將沉淀的原生質體懸浮在2ml?0.2mol/L的CaCl₂中，用移液器向離心管底部緩緩注入質量濃度為20％蔗糖溶液后離心，取在兩相溶液的界面之間純化的原生質體帶，用6ml?0.2mol/L的CaCl₂懸浮；

(5)原生質體的活力測定：采用臺盼藍染色法鑒定原生質體的活性，重復三次取平均數；

(6)將兩種草莓的原生質體以1∶1體積比混合，用移液器將混合好的原生質體滴在6孔板內，靜置10min，使原生質體貼在6孔板底部，觀察其形態；

(7)吸取PEG溶液，等體積滴加在每滴原生質體上，輕輕轉動6孔板，使其混勻，靜止10min，觀察原生質體的聚集現象，并統計聚集體所占百分率，向其中依次間隔5min加入高Ca²⁺，高pH洗液洗滌，觀察聚集的細胞團的融合過程。

2.根據權利要求1所述的草莓原生質體的提取及融合方法，其特征是步驟(2)所述細條為2.0mm×2.0mm。

3.根據權利要求1所述的草莓原生質體的提取及融合方法，其特征是步驟(3)所述定時鏡下觀察酶解情況為酶液消化7小時后，每隔一小時在倒置顯微鏡下觀察。

4.根據權利要求1所述的草莓原生質體的提取及融合方法，其特征是步驟(4)所述取在兩相溶液的界面之間純化的原生質體，是用移液器吸出管底的沉淀和蔗糖溶液及上部的CaCl₂溶液。

5.根據權利要求1所述的草莓原生質體的提取及融合方法，其特征是步驟(6)所用原生質體濃度為0.5×10⁵個/mL，六孔板滴加時每滴為0.1mL。

6.根據權利要求1所述的草莓原生質體的提取及融合方法，其特征是步驟(7)所述PEG溶液組成為30-45％PEG?6000+0.3mM葡萄糖+8mM?Cacl₂+0.7mMKH₂PO₄，KOH調pH為5.8。

7.根據權利要求1所述的草莓原生質體的提取及融合方法，其特征是步驟(7)所述高Ca²⁺，高pH洗液為50mM?CaCl₂·2H₂O+0.2M甘氨酸，NaOH調pH為9-10。

8.根據權利要求1所述的草莓原生質體的提取及融合方法，其特征在于酶液組成為1.0％纖維素酶Cellulase?Onozuka?R-10+0.5％果膠酶PectolyaseY-23+0.6mol/L的甘露醇+0.1-0.2％2-(N-嗎啡啉)乙磺酸MES+0.05mol/L的CaCl₂的組合。

9.根據權利要求1-8任一所述的草莓原生質體的提取及融合方法，其特征步驟如下：

1)分別取綠葉東方草莓和盧比草莓試管苗移入降低了蔗糖濃度的MS培養基培養10天，MS培養基含有6-芐基腺嘌呤(6-BA)1.0mg/L，蔗糖1.5％和瓊脂0.7％；

2)取步驟1)預處理的葉片用剪刀剪成2.0mm×2.0mm大小細碎的小條并去除葉脈；

3)將材料與酶液按照體積比1∶10混合，用Parafilm封口，錫箔紙密封，置于搖床上在26℃恒溫，速度60r/min條件下進行暗酶解，7小時后每隔一小時鏡下觀察酶解情況，酶液組成為1.0％纖維素酶Cellulase?Onozuka?R-10+0.5％果膠酶Pectolyase?Y-23+0.6mol/L的甘露醇+0.1-0.2％2-(N-嗎啡啉)乙磺酸MES+0.05mol/L的CaCl₂的組合，酶消化時間為14小時；

4)將酶解完全的兩種草莓葉肉原生質體懸浮液經200目尼龍紗網過濾后，600R/min的轉速離心5min，使原生質體沉淀、去上清液，將沉淀的原生質體懸浮在2ml?0.2mol/L的CaCl₂中.用移液器向離心管底部緩緩注入20％蔗糖溶液后離心，取在兩相溶液的界面之間純化的原生質體帶，用3ml?0.2mol/L的CaCl₂懸浮；

5)采用臺盼藍染色法鑒定原生質體的活性，重復三次取平均數，調整原生質體密度為0.5×10⁵個/mL；

6)將兩種草莓的原生質體以1∶1體積比混合，用移液器將混合好的原生質體滴在6孔板內，每滴為0.1mL，靜置10min，使原生質體貼在6孔板底部，觀察其形態；

7)吸取30％PEG溶液，等體積滴加在每滴原生質體上，輕輕轉動6孔板，使其混勻，靜止10min，觀察原生質體的聚集現象，并統計聚集體所占百分率；向其中依次間隔5min加入高Ca²⁺，高pH洗液洗滌，觀察聚集的細胞團的融合過程；

臺盼藍染色法鑒定原生質體的活性為90％，在倒置顯微鏡下觀察并計算一對一的融合率為10.4％。