[發明專利]一種篩選抗HSV-1藥物的試劑盒和方法

無效

• 申請號: 201110314235.4
• 申請日: 2011-10-15
• 公開（公告）號: CN102363805A
• 公開（公告）日: 2012-02-29
• 發明（設計）人: 陳恬;曾南;陳洪宇;李學東;何婷
• 申請（專利權）人: 成都醫學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/44;C12N15/55;C12N15/63;C12N9/22
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽

技術領域

本發明涉及藥物篩選領域，具體涉及一種篩選抗HSV-1藥物的試劑盒和方法。?

背景技術

單純皰疹病毒I型(HSV-1)為有包膜的DNA病毒，是危害人類健康的常見病原體，且容易導致復發性感染和潛伏感染。HSV-1感染部位廣泛，能引起口唇皰疹、生殖器皰疹、腦炎、角膜炎等，并與宮頸癌和唇癌有關。HSV-1具有神經毒性，可侵犯中樞神經系統、破壞神經細胞。目前，治療由HSV-1引起的上述疾病的有效藥物主要為阿昔洛韋(ACV)，其吸收差，且根據國家藥品不良反應監測中心病例報告顯示，其引起的急性腎功能損害和血尿問題突出。因此，篩選更多抑制該病毒的藥物非常必要。?

現有技術中公知的主要篩藥體系仍為傳統的動物模型篩藥體系和細胞模型篩藥體系，存在實驗周期較長，實驗步驟較復雜等缺點，難以迅速將潛在藥物篩選出來，不能滿足藥物研發初期高通量快速篩選藥物的要求。?

堿性核酸酶是由HSV-1基因組中UL12基因編碼的，已經被報道有5’～3’的核酸外切酶和核酸內切酶活性，因其反應的最適pH值較高，所以被認為是堿性核酸酶。在HSV-1的復制中起著重要的作用，有研究證實堿性核酸酶能正確修復DNA復制過程中的斷裂和缺口，并能使處于復制狀態的病毒基因組易于包裝。該編碼基因被敲除后HSV-1突變體復制幾乎停止，說明堿性核酸酶為病毒體內繁殖所必須。還有實驗證明，在非容納細胞中產生的UL12基因組缺陷病毒，由于有異常基因組而很難感染新的細胞。上述研究證明堿性核酸酶在病毒的復制及其感染過程中是非常關鍵的，這為堿性核酸酶成為一種新的抗皰疹病毒藥物篩選靶點提供了證據。?

也就是說，能夠抑制堿性核酸酶活性的物質也具有抑制HSV-1的作用，進而推測這些物質具有治療由HSV-1引起的各種疾病的作用。因此，篩選治療這些疾病的潛在藥物可以通過檢測其能否抑制堿性核酸酶活性來實現。?

然而，UL12基因片段長，GC含量高，難以通過常規的PCR方法方便、準確地獲得全序列的UL12基因片段，進而獲得大量有活性的堿性核酸酶，目前也未見市售品出現，因此以堿性核酸酶作為篩藥體系關鍵成分制備快速篩藥系統難以適應臨床大量應用的需要。?

發明內容

為了克服現有技術存在的缺點，本發明提供了一種方便快捷地篩選大量抗HSV-1藥物的方法。?

因此，本發明目的之一是提供一種用于篩選抗HSV-1藥物的試劑盒，包含HSV-1堿性核酸酶、堿性緩沖液、MgCl₂和核酸。?

上述試劑盒內各成分濃度優選如下：HSV-1堿性核酸酶濃度為0.5～0.7mg/ml、堿性緩沖液濃度為40～60mM、MgCl₂濃度為2～4mM、核酸濃度為1.4～1.6μg/ml。?

上述試劑盒內各成分濃度進一步優選如下：HSV-1堿性核酸酶濃度為0.64mg/ml、堿性緩沖液濃度為50mM、MgCl₂濃度為3mM和核酸濃度為1.516μg/ml。?

為了克服現有技術難以方便獲得大量有活性的堿性核酸酶的缺陷，本發明試劑盒中HSV-1堿性核酸酶是用如下方法得到的：其步驟如下：?

(1)擴增目的基因：提取HSV-1病毒基因組作為模板，以SEQ?ID?NO：1～2所示的核苷酸序列作為引物擴增HSV-1的UL12基因片段，擴增程序為：96℃預變性3min，95℃變性40s，68℃～72℃退火延伸2min30s，31個循環，72℃延伸10min；膠回收并純化擴增的UL12基因片段；?

(2)構建重組質粒：用內切酶將步驟(1)獲得的UL12基因片段與表達質粒連接，獲得重組質粒；?

(3)誘導表達：將步驟(2)獲得的重組質粒轉化至大腸桿菌，涂布在含有適當抗生素的平板上；培養重組質粒的大腸桿菌轉化子使其生長至對數期；加入異丙基2b-D2硫代半乳糖苷酶(IPTG)誘導表達；離心收集菌體；?

(4)變性：a，用含有變性劑的洗滌液兩次洗滌步驟(3)得到的菌體；b，冷凍超聲破碎細胞，離心收集沉淀；c，用含有不同變性劑的多種洗滌液分別洗滌沉淀，離心，收集沉淀；d，用含有高濃度變性劑的洗滌液超聲洗滌沉淀，得到蛋白溶液；?

(5)復性：用鹽酸胍濃度逐步減小的復性液復性步驟(4)得到的蛋白溶液，獲得活性蛋白。?