[發明專利]L-02細胞作為具有肝功能的細胞源的醫學應用

無效

• 申請號: 201110307209.9
• 申請日: 2011-10-12
• 公開（公告）號: CN102397583A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發明（設計）人: 周平;胡昕鵬;楊濤;孟凡迎;林菊生
• 申請（專利權）人: 華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院
• 主分類號: A61L27/38
• 分類號: A61L27/38;A61K35/407;A61P1/16;C12Q1/02
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 王和平

技術領域

本發明屬于生物技術和醫藥領域，具體涉及L-02細胞的肝細胞功能研究，及其在體外培養增殖后在肝細胞移植、治療急性肝功能衰竭和肝細胞功能相關的醫學研究等中的應用。

背景技術

急性肝衰竭(Acute?liver?failure，ALF)死亡率很高，目前可根治急性肝衰竭的唯一方法是肝移植。但供肝數量遠遠不能滿足患者的需求，很多急性肝衰竭患者在等待肝移植的過程中死亡。除肝移植外，急性肝衰竭尚有兩種有效治療方法，即肝細胞移植和生物人工肝。用人源性肝細胞充填的生物人工肝是治療急性肝衰竭的一種公認有效的方法，可有效降低急性肝功能衰竭死亡率，可作為肝移植前的一種過渡性治療。肝細胞移植可以明顯降低急性肝功能衰竭死亡率，促進病肝再生和恢復，也可作為肝移植的過渡療法。肝細胞移植和生物人工肝都需要大量的肝細胞，很多肝細胞相關醫學研究也需要大量的肝細胞源，但目前人原代肝細胞的來源很困難，主要是可供分離肝細胞的肝臟來源不足，且原代肝細胞體外培養增殖極為困難。其他的一些可用細胞系，如干細胞、永生化肝細胞、異種肝細胞等，都有嚴重的不足，如永生化肝細胞潛在的致瘤危險性，異種肝細胞強烈的排異反應，有關干細胞的研究尚不充分等。

人胚胎肝細胞作為肝細胞移植和生物人工肝一種可用的細胞來源，已有相關研究證實了原代分離的胚胎肝細胞具有成人肝細胞類似的肝細胞功能。人胚胎肝細胞系L-02，是上世紀80年代由國內學者自行建系的胚胎肝細胞系，其體外培養容易，來源方便，目前多作為許多實驗的對照組細胞。但L-02細胞系是否具有肝細胞相關功能及是否能應用于肝細胞移植和生物人工肝，目前國內外文獻中尚無報道。

發明內容

本發明的目的是對人胎肝細胞系L-02細胞系進行肝細胞功能研究，并將其應用于肝細胞移植，研究其治療急性肝功能衰竭的效果，旨在提供一種新型可用、功能穩定、來源充足的具有良好肝功能的細胞系來源。

本發明的技術方案是：

本發明選擇了目前國內應用較多且來源方便、經無限繁代后的人胎肝細胞系L-02細胞系，對其進行肝細胞功能研究。將L-02細胞解凍后進行培養增殖，其貼壁后增殖迅速，傳代周期較穩定，以新生牛血清培養2至3天即可傳代，可完全滿足實驗的需求。對L-02細胞進行肝細胞功能檢測發現，L-02細胞表達多種肝細胞特異性因子，包括白蛋白、膽紅素葡糖醛酸基轉移酶、凝血因子、轉氨酶等，表明其具有確切的肝細胞功能。為進一步驗證L-02細胞對于急性肝衰竭的治療作用，本發明人選擇了大鼠90％肝切除誘導的急性肝衰竭模型。實驗中發現，實驗組大鼠肝切除術后存活時間明顯長于對照組大鼠，實驗組大鼠30天存活率達到70％以上，而對照組大鼠均于術后72小時內死亡，其差異具有統計學意義(P＜0.01)。對存活30天大鼠進行開腹觀察可見明顯肝臟再生。同時抽血檢測血氨及肝功能指標，證實L-02細胞能有效改善肝功能。

本發明的優點：

(1)本發明所用的人胎肝細胞系L-02細胞系來源方便，無成瘤危險性，且易在體外大量培養增殖，適合臨床推廣。

(2)本發明證明L-02細胞具有良好的肝細胞功能，可以作為良好的人源肝細胞替代來源，用于在治療急性肝功能衰竭中的應用，為L-02細胞在醫學實驗研究上的應用奠定了基礎。

附圖說明

圖1：SD大鼠肝臟解剖圖。

圖2：顯微鏡下觀察L-02細胞(X?100)。

圖3：RT-PCR檢測L-02細胞肝細胞相關因子的表達。從左至右依次為：白蛋白(ALB)、人凝血因子-X(HBCF-X)、谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)。

圖4：Western-blot檢測L-02肝細胞白蛋白的表達。圖A從左至右依次為：L-02細胞、Hepg-2細胞、人原代肝細胞；圖B為β-actin條帶。

圖5：L-02細胞免疫熒光染色，FITC標記白蛋白，激光共聚焦顯微鏡下觀察白蛋白的分泌情況。圖A、圖B分別為20倍及60倍下觀察所見，肝細胞質染成綠色顆粒狀。圖C為100倍下所見，藍色為DAPI所染胞核，胞質內見綠染的白蛋白顆粒。

圖6：L-02細胞免疫熒光染色，TRITC標記葡糖醛酸基轉移酶(UGT1A1)，激光共聚焦顯微鏡下觀察。圖A為60倍鏡下觀察所見，圖B為100倍鏡下見，藍色為DAPI所染的胞核。兩圖均可見胞質內紅染的UGT1A1顆粒。

圖7：L-02移植、90％肝切除后分別測定并計算各組大鼠的存活率、血氨、白蛋白、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、總膽紅素、直接膽紅素及堿性磷酸酶水平。其中G1為移植L-02細胞的實驗組，G2為對照組。