[發明專利]克隆青蝦CHH基因的引物組及克隆青蝦CHH基因的方法

無效

• 申請號: 201110303794.5
• 申請日: 2012-02-06
• 公開（公告）號: CN102433329A
• 公開（公告）日: 2012-05-02
• 發明（設計）人: 吳滟;王寧;傅洪拓;喬慧
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院淡水漁業研究中心
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/16;C12N15/10
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀昌

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技術領域

發明涉及CHH基因，具體地說是一種青蝦（Macrobrachium?nipponense）CHH基因和編碼蛋白及其克隆方法。?

背景技術

CHH家族激素在調控甲殼運物的蛻皮、變態發育、生殖、血糖平衡以及體內的滲透壓等方面起著重要的作用。?

甲殼類高血糖激素(Crustacean?hyperglycemic?hormone，CHH)是CHH家族的一員，可以通過調控磷酸化酶、糖原合成酶以及中腸淀粉酶活性使無眼柄的甲殼動物血糖增加，CHH根據內部信號如血淋巴中葡萄糖量，外部信號如缺氧、寄生蟲感染、熱激、污染物等做出反應。除了糖代謝外，CHH也參與脂代謝(Santos等，1997)、控制鰓的離子轉運(Pienot等，2000)以及調節滲透壓。?

研究表明，克氏原鰲蝦(Procambarus?clarkii)的CHH異構體對大顎器官MF的合成具有抑制作用(Laufer等，1994)，同樣無緣蜘蛛蟹(Libinia?emarginata)的CHH異構體也對MF的合成也具有調節作用(Liu等，1997)。?

許多證據顯示CHH對生殖具有促進作用：Tensen等(1989)利用異源體內生物活性檢測的方法，發現美洲鰲龍蝦(Homarus?americanus)的兩種CHH-B的異構體對來自無常小長臂蝦(Palaemonetes?varians)的非卵黃發生期的卵細胞的生長具有促進作用，另外在同源體外生物活性檢測中也發現兩種CHHB異構體對生殖具有促進作用(Van?Herp，1992)。雌性美洲鰲龍蝦卵黃發生前期CHH-A與CHH-B的mRNA水平及眼柄中CHH的濃度顯著變高，在卵成熟過程中，血淋巴中的CHH-A與CHH-B濃度亦變高，而GIH濃度變高的階段則出現在卵黃發生前期及未成熟期。這一結果表明，CHH-A與CHH-B對卵黃發生起著激發作用，GIH則對卵黃發生起著抑制作用。?

甲殼類高血糖激素(Crustacean?hyperglycemic?hormone，CHH)，是甲殼動物眼柄中含量最豐富且被研究的最多的激素。目前關于青蝦CHH的研究尚未進行。因此，本發明以青蝦眼柄為材料，分離了青蝦CHH的全長cDNA序列，并對其所編碼的神經肽的序列特征、同源性、進化地位進行了分析，為全面掌握其生理功能提供了基礎資料，為進一步研究青蝦CHH基因的表達、調控奠定了基礎，同時也為甲殼動物整個CHH家族的功能和進化研究提供了新的材料。?

發明內容

有鑒于此，本發明提供克隆青蝦CHH基因系列的引物組和編碼蛋白及其克隆方法。利用本發明提供的引物組首次從青蝦眼柄中克隆到了一種CHH基因，為進一步研究CHH基因參與血糖調節、脂代謝、離子轉運、滲透壓以及促進卵黃生成作用等奠定基礎，為青蝦繁殖生理功能研究提供參考。?

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：?

本發明提供了擴增青蝦AST基因全長cDNA序列的引物組，其由如下引物組成：

引物組1：

正向引物FS1的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示；

反向引物RS4的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示；

引物組2：

正向外引物FC3-2的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:3所示；

正向內引物FC3-3的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:4所示；

反向外引物3′?RACE?Outer?Primer的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:5所示；

反向內引物3′?RACE?Inner?Primer的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:6所示。

引物組3：?

正向外引物RC5-1的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:7所示；

正向內引物RC5-3的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:8所示；

反向外引物5′?RACE?Outer?Primer的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:9所示；

反向內引物5′?RACE?Inner?Primer的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:10所示。

本發明還提供了一種克隆青蝦CHH基因全長序列的方法，包括如下步驟：?

步驟1：從青蝦眼柄中提取總RNA；

步驟2：然后RT進行cDNA?第一鏈合成；