[發明專利]雙標記核酸恒溫擴增方法及檢測試紙條

無效

• 申請號: 201110293316.0
• 申請日: 2011-09-28
• 公開（公告）號: CN102329790A
• 公開（公告）日: 2012-01-25
• 發明（設計）人: 張改平;王德國;鄧瑞廣;郭軍慶;李學伍;邢廣旭;趙東
• 申請（專利權）人: 河南省農業科學院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68;C12Q1/70;C12Q1/04
• 代理公司: 鄭州大通專利商標代理有限公司 41111
• 代理人: 張愛軍

技術領域

本發明涉及一種基于環介導等溫擴增方法及試紙條，特別是涉及一種雙標記核酸擴增方法及其快速檢測試紙條。

背景技術

隨著現代分子生物學和分子技術的發展，研究開發了許多核酸擴增技術。其中核酸環介導恒溫擴增技術（loop-mediated?isothermal?amplification，LAMP），由于其具有特異性強、靈敏度高、反應速度快等特點，在核酸特異性擴增和檢測領域具有取代PCR的趨勢，成為生命科學領域研究的熱點之一。核酸環介導擴增的主要原理是基于對靶序列的6個區域設計2對特異引物，利用一種鏈置換?DNA?聚合酶（Bst?DNA?polymerase），在65℃左右的恒溫條件下保溫約60分鐘，完成核酸擴增反應，在存在環引物的情況下，擴增時間可進一步縮短為40分鐘。用于LAMP擴增的3對引物對應于靶基因的8個區段，因而具有比PCR?更高的特異性，同時具備不需要熱循環、擴增效率更高、不需要特殊儀器等優點。

目前LAMP產物的檢測經常采用電泳法和濁度法，需要用高致癌性的熒光染料溴化乙錠，不僅危害操作人員的健康，而且無法排除假陽性的問題，限制了LAMP技術的推廣使用。

發明內容

本發明要解決的技術問題：克服現有技術的缺陷，提供一種特異性強、靈敏度高、速度快的雙標記核酸恒溫擴增方法；

還提供了一種用雙標記核酸恒溫擴增產物得到的簡易檢測試紙條，該試紙條可廣泛用于各種致病性微生物或病原體中特異性基因的檢測。

本發明的技術方案：

一種雙標記核酸恒溫擴增方法，根據檢測目標設計LAMP?引物，進行內引物、外引物和環引物的合成；用生物素和熒光素分別標記兩種內引物，或分別標記兩種環引物，或分別標記一種內引物和一種環引物，將標記引物加入LAMP反應體系中恒溫擴增，得到雙標記核酸恒溫擴增產物。?

所述標記是標記內引物各引物的5’端；所述熒光素為異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明或四甲基異硫氰酸羅丹明。

所述恒溫擴增是在59-65℃溫度下、恒溫擴增5-20min。

?一種含有雙標記核酸恒溫擴增產物的檢測試紙條，含有支撐層、吸附層，支撐層為不吸水薄片條，吸附層粘貼于支撐層上，所述吸附層從測試端依次為測試端纖維層、纖維素膜層和手柄端吸水材料層，所述纖維素膜層含有權利要求1所述的雙標記核酸恒溫擴增產物，用生物素親和蛋白及熒光素抗體分別在纖維素膜層上印制檢測印跡和對照印跡，或用生物素親和蛋白及熒光素金標抗體分別在纖維素膜層上印制檢測印跡和對照印跡，檢測印跡和對照印跡平行排列為“????????????????????????????????????????????????”。

所述不吸水薄片條為硬質塑料片條或不吸水硬紙片條，所述纖維素膜層是用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜制成，所述手柄端吸水材料層是用吸水紙制成，所述測試端纖維層是用玻璃棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成。

所述熒光素為異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明或四甲基異硫氰酸羅丹明。

所述測試端吸附纖維層、吸水材料層上均覆蓋有保護膜，在測試端纖維層的保護膜上印制有樣品標記線，該標記線距離測試端0.5cm。

所述的檢測試紙條在檢測各種致病性微生物或病原體的特異性基因中的應用。

本發明的積極有益效果：

１.?本發明的雙標記核酸恒溫擴增方法具有下列優點：

（1）特異性強，用于LAMP擴增的3對或2對引物分別對應于靶基因的8個或6個區段，理論上可以檢測出一個堿基差異的序列，因而具有比PCR?更高的特異性；

（2）靈敏度高，LAMP能在模板DNA純度很低的情況下進行擴增，很少受培養介質和生物學物質的影響，純化步驟可以忽略；

（3）速度快，LAMP是恒溫擴增反應，沒有?PCR反應中溫度變化的耗時，在30～60min內即可完成反應過程，10?min內即可完成擴增反應，結合本發明中試紙條檢測手段，試紙檢測可在5min內完成，加上前處理過程，可在1小時左右完成對樣品的檢測；

（4）易推廣，LAMP反應是一個恒溫擴增過程，不用控制溫度變化，只需簡單的恒溫器，也不需要昂貴的?PCR儀，對操作人員的分子生物學技術要求不高。

２.本發明的檢測試紙條可廣泛用于各種致病性微生物或病原體中特異性基因的檢測，具體包括：