[發(fā)明專利]一種酪蛋白活性單肽及其制備方法與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110292957.4
• 申請日: 2011-09-30
• 公開（公告）號: CN102352398A
• 公開（公告）日: 2012-02-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙強(qiáng)忠;趙謀明;崔春;張清麗
• 申請（專利權(quán)）人: 華南理工大學(xué)
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/20;C07K1/16;C07K7/06;A23C9/13
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 何淑珍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉發(fā)酵乳制備的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從酪蛋白酶解液分離得到的具有具有提高發(fā)酵液中多糖含量的生物活性單肽及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

發(fā)酵乳是指在保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的作用下，使用添加?(?或不添加?)乳粉(?全脂或脫脂)的乳進(jìn)行乳酸發(fā)酵而得到的凝固乳制品，最終產(chǎn)品中必須含有大量的活菌。乳酸菌的發(fā)酵作用可以使乳白蛋白變成微細(xì)的凝乳粒，易于消化吸收，發(fā)酵過程中乳酸菌可以產(chǎn)生機(jī)體營養(yǎng)所必需的維生素、煙酸和葉。發(fā)酵乳除了保留了牛奶的全部營養(yǎng)外,其與鮮奶最顯著的差異就是在于它還含有大量的乳酸及易于人體腸道健康的活性乳酸菌。

乳酸菌胞外多糖是乳酸菌在生長代謝過程中形成的位于細(xì)胞壁外的粘液多糖或莢膜多糖，屬于微生物胞外多糖的一種。乳酸菌胞外多糖對于發(fā)酵乳制品形成良好的質(zhì)構(gòu)特征起著十分重要的作用，由于乳酸菌保外多糖作為生物高分子的特性而能改善產(chǎn)品的流變學(xué)特性，增強(qiáng)產(chǎn)品的穩(wěn)定性和持水能力，使有關(guān)產(chǎn)品生產(chǎn)中不添加或少添加增稠劑、乳化劑等添加物，并賦予產(chǎn)品良好的口感和風(fēng)味。此外研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌胞外多糖還具有突出的生理功能，如抗腫瘤、調(diào)理腸道、免疫調(diào)節(jié)、抗致突變、細(xì)胞保護(hù)和降低血清膽固醇等。

因此，通過在發(fā)酵乳中添加酪蛋白生物活性肽，有效地促進(jìn)發(fā)酵乳發(fā)酵過程中胞外多糖的分泌和提高發(fā)酵液中多糖含量，對發(fā)酵乳行業(yè)具有重大的經(jīng)濟(jì)價值和現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種有牛乳來源的、高安全性的、具有可產(chǎn)業(yè)化的酪蛋白活性單肽及其制備方法與應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種酪蛋白活性單肽的制備方法，包括如下步驟：

（1）在50℃～55℃，pH?6.0-7.5的條件下加入木瓜蛋白酶對酪蛋白進(jìn)行酶解，得酶解液；

（2）當(dāng)水解度達(dá)到9％～10％時，90～95℃加熱15～20min滅酶，終止酶解反應(yīng)以控制生物活性肽的分子量；

（3）將滅酶活的酶解液依次通過膜分離、大孔樹脂、凝膠色譜、反相高效液相進(jìn)行分離純化，即得所述生物活性肽。

上述的制備方法中，步驟（3）中將滅酶活的酶解液在4℃下以6000?g離心20分鐘，將上清液經(jīng)超濾，取分子量小于3000道爾頓的組分，采用大孔樹脂NKA-II,?收集10-20%（w/w）乙醇洗脫液，接著采用Sephadex?G-25,流動相為去離子水，檢測波長220nm，按吸收峰順序收集；經(jīng)Sephadex?G-25分離得到的活性的組分再經(jīng)C₁₈高效液相色譜分離純化，分離條件為：5-40%乙腈和95-60%去離子水梯度洗脫，檢測波長220nm，按吸收峰順序收集。

由上述制備方法制得的具有提高發(fā)酵液中多糖含量的酪蛋白活性單肽。

上述制得的酪蛋白活性單肽，通過液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜測定其分子量為801.4道爾頓，該活性單肽氨基酸序列為：Asn-Pro-Ser-Lys-Glu-Asn-Leu。

上述酪蛋白活性單肽的應(yīng)用，具體是將酪蛋白活性單肽與甘油混合應(yīng)用于發(fā)酵乳發(fā)酵中，提高發(fā)酵液中多糖含量。所述應(yīng)用中，以發(fā)酵乳總重計(jì)，酪蛋白活性單肽的添加量為0.001%-0.1%；甘油添加量為0.1%-2%。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用了以上技術(shù)方案，具有如下優(yōu)點(diǎn)和效果：

1、本發(fā)明通過對酪蛋白酶解液的進(jìn)一步分離、純化得到了活性肽NPSKENL，該活性肽與甘油共同添加到發(fā)酵乳中，具有明顯提高發(fā)酵乳中多糖含量作用。

2、本發(fā)明分離純化所得的生物活性肽是從酪蛋白中分離得到的乳源性肽，可以安全的添加的到酸乳中。

附圖說明??

圖1為實(shí)施方式中Sephadex?G-25對酪蛋白酶解液的初步分離圖。

圖2為實(shí)施方式中RP-HPLC對生物活性肽的分離純化圖。

圖3為實(shí)施方式中添加生物活性單肽和甘油制備的發(fā)酵乳與空白對照中多糖含量的變化曲線。

具體實(shí)施方案

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明的具體實(shí)施作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的實(shí)施和保護(hù)范圍不限于此。

實(shí)施例1：利用酪蛋白酶解液生產(chǎn)具有提高發(fā)酵液中多糖含量的生物活性單肽

1、?可控酶解：在50℃，pH?6.0的條件下加入木瓜蛋白酶對酪蛋白進(jìn)行酶解，得酶解液。

2、?酶解液滅酶：90℃加熱15min滅酶，終止酶解反應(yīng)。

3、將滅酶活的酶解液離心（6000?x?g，4℃）20分鐘，將上清液經(jīng)超濾（取分子量小