[發明專利]一種特異性識別鼠傷寒沙門氏菌的寡核苷酸適配子的篩選及應用

有效

• 申請號: 201110291363.1
• 申請日: 2011-09-30
• 公開（公告）號: CN103031305A
• 公開（公告）日: 2013-04-10
• 發明（設計）人: 王周平;段諾;吳世嘉
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12N15/10;C12Q1/68;C12Q1/04
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技術領域

本發明涉及利用SELEX技術(指數富集的配體系統進化技術)篩選獲得一種與鼠傷寒沙門氏菌高親和力、高特異性識別的寡核苷酸適配子，以及該寡核苷酸適配子在鑒別沙門氏菌中的應用，屬生物技術領域。

背景技術

鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella?Typhimurium)，屬腸桿菌科，革蘭氏陰性腸道桿菌。沙門氏菌病是公共衛生學上具有重要意義的人畜共患病之一。在我國內陸地區，由沙門氏菌引起的食物中毒屢居首位。據資料統計，在我國細菌性食物中毒中，70％--80％是由沙門氏菌引起，世界各地的食物中毒中，英國、中國沙門氏菌食物中毒居首位。目前，在全球范圍內，特別是發展中國家感染沙門氏菌的人數逐年增多，食源性致病菌的耐藥性對食品安全及人類健康的影響已經引起很多國家的警惕。因此建立準確、靈敏、快速的沙門氏菌檢測技術對于食品安全具有重要意義。

傳統的微生物檢驗，往往既耗時又不靈敏；新發展起來的PCR技術，雖然能縮短檢驗時間，但靈敏度仍然不高；免疫學方法具有特異性強、靈敏度高、易于觀察等優點，但制備抗體的時間比較長，成本高，且不穩定。近些年來，由于寡核苷酸適配子(aptamer)較之抗體有諸多優點：成本低，穩定性好，易于修飾等等，因此被作為抗體分子的前景性替代分子，受到很多領域的關注。SELEX是一種隨機生物文庫技術，它利用大容量的隨機寡核苷酸庫(由兩端的固定序列和中間20～40個堿基的隨機序列組成)與靶分子相互作用，從中篩選出與靶分子特異結合的寡核苷酸，并結合PCR體外擴增技術，使其得到指數級富集，如此循環數輪，最終進化成為高親和力、高特異性的寡核苷酸配體。適配子與靶物質結合的特異性和親和力可與抗體媲美，甚至優于抗體，加上其技術上和穩定性方面的優勢，近10多年來，采用SELEX技術篩選核酸適配子不斷被應用于生命科學各個領域的研究工作中，包括對疾病的診斷與治療。

本發明以常見的鼠傷寒沙門氏菌為目的靶細菌，利用SELEX技術獲得了一條能與鼠傷寒沙門氏菌高親和力，高特異性結合的寡核苷酸適配子，能夠快速、靈敏、特異的檢測到鼠傷寒沙門氏菌。

發明內容

本發明目的在于提出特異識別鼠傷寒沙門氏菌的一條寡核苷酸適配子的序列以及應用。

本發明優點：

1)與蛋白類抗體相比，aptamer合成周期短，成本低；aptamer更穩定；aptamer可直接體外合成、易于標記，使得操作更為簡單迅速。

2)該序列是從9條均能識別鼠傷寒沙門氏菌的aptamer中，選出的親和力最強，特異性最好的一條aptamer，能高親和力高特異性識別鼠傷寒沙門氏菌。

附圖說明

圖1S1-S9二級結構

圖2S1-S9解離常數

圖3S2的特異性分析圖

具體實施方式：

下面是通過SELEX技術篩選特異性結合鼠傷寒沙門氏菌的寡核苷酸適配子的方法以及快速檢出鼠傷寒沙門氏菌的應用。

1、合成隨機單鏈DNA文庫和引物(IDT公司合成)

隨機ssDNA文庫：

5’-ATAGGAGTCACGACGACCAGAA-N40-TATGTGCGTCTACCTCTTGACTAAT-3’

構建了長度為87nt的隨機ssDNA文庫，兩端為固定引物序列，中間為40個堿基的隨機序列，庫容量在10¹⁴以上；引物I：5’-ATAGGAGTCACGACGACCAGAA-3’；引物II：5’-ATTAGTCAAGAGGTAGACGCACATA-3’，將隨機ssDNA文庫和引物用TE緩沖液配制成100μmol/L貯存液-20℃保存備用。

2、BBL液體培養基培養鼠傷寒沙門氏菌，37℃搖床培養至對數生長期(OD₆₀₀＝0.3)，收集菌液1800g?4℃離心5min，棄上清，用1×結合緩沖液(1×BB)(50mM?Tris-HCl(pH?7.4)，5mM?KCl，100mM?NaCl，1mM?MgCl₂)清洗，去除多余的培養基成分。

3、SELEX篩選獲得鼠傷寒沙門氏菌特異的寡核苷酸適配子