[發明專利]三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因及其編碼蛋白和應用

無效

• 申請號: 201110290506.7
• 申請日: 2011-09-23
• 公開（公告）號: CN102329803A
• 公開（公告）日: 2012-01-25
• 發明（設計）人: 崔朝霞;劉媛
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C07K14/435;A61K38/17;A61P31/04;A61P31/10;A61P37/04;A23K1/16;A23L3/3544
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體的說是一種三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因及其編碼蛋白和應用。

背景技術

三疣梭子蟹(Portunus?trituberculatus)是一種重要的海產經濟蟹類，由于其營養價值豐富、生長迅速等優點，已成為我國重要海水養殖品種。但隨著養殖規模不斷擴大以及集約化程度不斷提高，由細菌、真菌等引起的多種疾病在三疣梭子蟹養殖群體中頻頻爆發，造成了巨大的經濟損失，嚴重制約了三疣梭子蟹養殖產業的健康可持續發展。

由于對三疣梭子蟹的免疫系統缺乏深入了解，目前蟹病的防治仍主要采用傳統抗生素藥物防治，但長期盲目濫用藥物，造成抗藥性問題日益嚴重，非但難以有效地控制病情，反而帶來資金的浪費，蟹品質的下降，環境污染及對人類健康構成潛在威脅等不良后果。因此，這就迫切需要從三疣梭子蟹自身的免疫防御因子入手研究其抗病機制和開發新型的抗菌藥物進行免疫防治。

抗脂多糖因子(ALF)是一種能夠結合脂多糖(LPS)并中和其毒性作用的小分子抗菌肽，因其作用機制與傳統抗生素不同，細菌不易產生耐藥性，對正常真核細胞無毒害，日益受到廣泛關注。ALF最初是從美洲鱟中發現，它可以結合LPS，并對R型革蘭氏陰性菌有明顯的抑制生長作用。晶體結構分析表明，鱟ALF結構中有兩個高度保守的半胱氨酸殘基，它們形成二硫鍵所限制的β折疊區域即為LPS結合域。體外合成鱟ALF的LPS結合域，證明其確實可以與LPS結合，能夠在體外調節細胞因子的分泌，有助于保護小鼠免受內毒素的攻擊。隨后，從對蝦、螯蝦、蟹等甲殼動物中也鑒定或克隆出多種抗脂多糖因子。研究表明這些甲殼動物ALF的表達水平在細菌刺激后明顯上調，其重組蛋白能夠抑制革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的生長，提示ALF在甲殼動物固有免疫中發揮重要作用。

到目前為止，關于三疣梭子蟹抗脂多糖因子的報道較少。因此，識別、定性抗菌效應分子-抗脂多糖因子對研究三疣梭子蟹的免疫防御機制和進行病害防治具有重要的理論和實踐意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因及其編碼蛋白和應用。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

一種三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因：三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因為序列表SEQ?ID?No.1中的堿基序列所示。

三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因編碼蛋白：所述PtALF-6基因編碼蛋白為序列表SEQ?ID?No.2中氨基酸序列所示。

三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因編碼蛋白的應用：所述三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因的重組表達產物可制備為抗菌藥物、免疫增強劑、飼料添加劑、防腐劑或保鮮劑。

所述三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因的重組表達產物可作為革蘭氏陰性菌、真菌的抑菌藥物。所述革蘭氏陰性菌為溶藻弧菌、銅綠假單胞菌、愛德華氏菌，真菌為畢赤酵母。

本發明所具有的優點：

本發明利用表達序列標簽技術(EST)、RACE技術從三疣梭子蟹中克隆到PtALF-6基因cDNA全長序列，通過PCR技術擴增編碼PtALF-6成熟肽的基因片段并將其克隆到pET32a(+)表達載體中，在大腸桿菌BL21(DE3)-plysS實現體外重組表達。重組蛋白經TALON柱純化和透析復性后，對革蘭氏陰性菌溶藻弧菌、銅綠假單胞菌、遲緩愛德華氏菌、真菌畢赤酵母具有顯著的抑菌活性，最小抑菌濃度分別為1.00μM、2.01μM、16.08μM、16.08μM；而對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌沒有明顯的抑制作用。

本發明基因及其重組蛋白在藥物生產、免疫增強劑、飼料添加劑以及防腐劑和保鮮劑生產中的應用，另外還可以進一步研究三疣梭子蟹免疫防御機制提供基礎，并為三疣梭子蟹的病害防治、基因輔助選育和飼料添加劑。

附圖說明

圖1為本發明實例提供的純化的三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6編碼成熟肽的基因擴增產物(其中，M：DNA?marker，1：成熟肽的基因擴增產物)。

圖2為本發明實例提供的誘導和純化的三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6重組蛋白(其中M：蛋白marker；1：未誘導菌體中表達的蛋白；2：IPTG誘導后表達的蛋白；3：純化的重組蛋白)。

具體實施方式

下面的實施例中將本發明作進一步闡述，但本發明不限于此。

本發明中的三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6的cDNA序列克隆包括下列步驟：