[發(fā)明專利]一種乙型肝炎病毒的分離方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110278440.X
• 申請日: 2011-09-19
• 公開（公告）號: CN102993294A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 冉兵
• 申請（專利權(quán)）人: 冉兵
• 主分類號: C07K14/705
• 分類號: C07K14/705;C07K1/14;G01N33/68;G01N27/62
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明涉及一種乙型肝炎病毒的分離方法，尤其是HBV具有嚴(yán)格的宿主易感性和嗜肝性，感染早期HBV表面抗原特定肽段與肝細(xì)胞上特異受體識別并結(jié)合，介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞，啟動HBV的復(fù)制周期。因此病毒的受體是HBV進(jìn)入肝細(xì)胞的門戶，阻斷HBV與其受體的結(jié)合是治療乙型肝炎的重要途徑之一。

【背景技術(shù)】

乙型肝炎病毒(Hepatitis?B?Virus，HBV)感染是當(dāng)前嚴(yán)重的全球健康問題之一，目前全世界約有3.5億人感染HBV，占全部人口的6％。其中相當(dāng)一部分感染者發(fā)展為慢性肝炎，少數(shù)還發(fā)展為肝硬化。慢性乙型肝炎至今仍缺乏有效的控制手段和徹底解決方案，臨床常用的抗病毒藥物療效有限，不能有效阻斷HBV在肝組織內(nèi)的復(fù)制和再感染。HBV與肝細(xì)胞之間相互作用分子機(jī)制的研究進(jìn)展相對滯后是嚴(yán)重影響新型治療方法和藥物研發(fā)的重要原因之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種乙型肝炎病毒的分離方法，它從目前已有對HBV感染早期過程的研究結(jié)果來看，因缺乏合適的體外感染模型，對HBV感染的早期過程，如病毒如何結(jié)合靶細(xì)胞上的受體并最終進(jìn)入細(xì)胞等機(jī)制，仍不清楚。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用技術(shù)方案是：由于HBV?PreS1區(qū)是病毒吸附肝細(xì)胞最重要的附著部位，本方法擬采用免疫沉淀技術(shù)直接尋找原代人肝細(xì)胞表面HBV?PreS1結(jié)合蛋白，即候選受體，進(jìn)一步克隆其基因，研究候選受體功能從而實(shí)現(xiàn)鑒定的方法。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：從分子水平上探討病毒受體的本質(zhì)，從而揭示病毒與宿主細(xì)胞受體之間的關(guān)系。對抗病毒疫苗及抗病毒藥物設(shè)計(jì)產(chǎn)生重大影響。

【具體實(shí)施方式】

1、通過PCR方法擴(kuò)增PreS1不同基因片斷，克隆入帶Flag標(biāo)簽的真核細(xì)胞分泌型表達(dá)載體pCMV-CFT，進(jìn)一步分離純化Flag-PreS1融合蛋白。

2、取行部分肝葉切除術(shù)患者的正常肝組織(約40g左右)，按照Protzer?U等報(bào)道的兩步膠原酶灌注法分離肝細(xì)胞，培養(yǎng)鑒定。

3、用純化表達(dá)的Flag-PreS1融合蛋白與人原代肝細(xì)胞(primary?human?hepatocyte，PHH)裂解物充分孵育，融合蛋白與肝細(xì)胞膜上結(jié)合蛋白復(fù)合物可通過與FITC-標(biāo)記的抗Flag單抗(Sigma)特異性結(jié)合，通過流式細(xì)胞儀檢測鑒定融合表達(dá)的HBV?PreS1片段對PHH的細(xì)胞結(jié)合活性。