[發(fā)明專利]弓形蟲總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條及其制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110278384.X
• 申請日: 2011-09-19
• 公開（公告）號: CN102435744A
• 公開（公告）日: 2012-05-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張忠英;劉莉莉;林麗蓉;楊天賜;張長弓
• 申請（專利權(quán)）人: 廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/531;G01N33/532
• 代理公司: 廈門南強(qiáng)之路專利事務(wù)所 35200
• 代理人: 馬應(yīng)森

1.弓形蟲總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條，其特征在于設(shè)有載體板、加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜、弓形蟲總抗體檢測線、對照線和吸收墊；加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜和吸收墊依次粘貼在載體板上表面，加樣墊的一端設(shè)在膠體金墊的一端上，膠體金墊的另一端設(shè)在硝酸纖維膜的一端上，吸收墊的一端設(shè)在硝酸纖維膜的另一端上，弓形蟲總抗體檢測線和對照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上；在弓形蟲總抗體檢測線處包被抗人Ig單克隆抗體，在對照線處包被羊抗弓形蟲抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7的IgG抗體。

2.如權(quán)利要求1所述的弓形蟲總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條，其特征在于所述載體板為PVC板。

3.如權(quán)利要求1所述的弓形蟲總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

1)制備弓形蟲重組抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7

采用基因克隆技術(shù)，PCR擴(kuò)增編碼弓形蟲抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表達(dá)，得弓形蟲重組抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7；

2)硝酸纖維素膜的點(diǎn)樣

在硝酸纖維素膜總抗體檢測線上包被抗人Ig單克隆抗體，在對照線處包被羊抗弓形蟲抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7?IgG抗體，晾干；

3)制備膠體金

采用檸檬酸三鈉還原方法制備25nm膠體金，取1％氯金酸1mL加入到100mL去離子雙蒸水中，得到的氯金酸濃度為0.01％，置于帶冷凝裝置的燒瓶中加熱至沸騰，磁力加熱攪拌下加入1％檸檬酸三鈉水溶液2.0mL，繼續(xù)加熱直至溶液呈葡萄酒色為止，冷卻后置于棕色瓶中4℃冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

4)膠體金與SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7的標(biāo)記

(1)膠體金與弓形蟲抗原SAG1(P30)的標(biāo)記：取膠體金10mL，用0.1mol/L?NaOH調(diào)至pH5.4，加100μg?SAG1(P30)，混勻，放置5min，加入5％BSA?1m?L混勻，4℃、10?000r/min離心1h，棄上清，將沉淀用TBS緩沖液溶解至10mL，4℃、10?000r/min離心1h，棄上清，沉淀用TBS稀釋至1mL，得膠體金標(biāo)記的SAG1(P30)抗原；

(2)膠體金與弓形蟲抗原SAG2(P22)、ROP2和GRA7的標(biāo)記方法與步驟(1)相同，得膠體金標(biāo)記的SAG2(P22)、ROP2和GRA7抗原；

(3)將膠體金標(biāo)記的SAG1(P30)抗原、膠體金標(biāo)記SAG2(P22)、膠體金標(biāo)記ROP2抗原和膠體金標(biāo)記的GRA7抗原混合后，均勻地涂于玻璃纖維膜上，烘干，制備成膠體金墊；

5)制備免疫層析檢測條

將加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜和吸收墊依次粘貼在載體板上表面，加樣墊的一端設(shè)在膠體金墊的一端上，膠體金墊的另一端設(shè)在硝酸纖維膜的一端上，吸收墊的一端設(shè)在硝酸纖維膜的另一端上，弓形蟲總抗體檢測線和對照線依次設(shè)在硝酸纖維膜上；在弓形蟲總抗體檢測線處包被抗人Ig單克隆抗體，在對照線處包被羊抗弓形蟲抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7的IgG抗體，用切條機(jī)切成條狀，得弓形蟲總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條。

4.如權(quán)利要求3所述的弓形蟲總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述抗人Ig單克隆抗體的濃度為1～4mg/mL。

5.如權(quán)利要求3所述的弓形蟲總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述羊抗弓形蟲抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7的IgG抗體由抗SAG1(P30)抗體、抗SAG2(P22)、抗ROP2和抗GRA7抗體按體積比1∶1∶1∶1混合，其終濃度為1～4mg/mL；點(diǎn)樣量為1μL/cm。

6.如權(quán)利要求3所述的弓形蟲總抗體膠體金免疫層析檢測試劑條的制備方法，其特征在于在步驟3)中，所述檸檬酸三鈉的百分比濃度為2％。