[發明專利]弓形蟲IgM與IgG抗體聯合檢測試劑條及其制備方法

有效

• 申請號: 201110278051.7
• 申請日: 2011-09-19
• 公開（公告）號: CN102305861A
• 公開（公告）日: 2012-01-04
• 發明（設計）人: 林麗蓉;劉莉莉;張忠英;楊天賜;張長弓
• 申請（專利權）人: 廈門大學附屬中山醫院
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/544;G01N33/531;G01N33/558
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所 35200
• 代理人: 馬應森

1.弓形蟲IgM與IgG抗體聯合檢測試劑條，其特征在于設有載體板、加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜、弓形蟲IgG抗體檢測線、弓形蟲IgM抗體檢測線、對照線和吸收墊；所述加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜和吸收墊依次粘貼在載體板上表面，加樣墊的一端設在膠體金墊的一端上，膠體金墊的另一端設在硝酸纖維膜的一端上，吸收墊的一端設在硝酸纖維膜的另一端上，弓形蟲IgG抗體檢測線、弓形蟲IgM抗體檢測線和對照線依次設在硝酸纖維膜上；在弓形蟲IgG抗體檢測線處包被抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體，在弓形蟲IgM抗體檢測線處包被抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體，在對照線處包被羊抗弓形蟲抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7的IgG抗體。

2.如權利要求1所述的弓形蟲IgM與IgG抗體聯合檢測試劑條，其特征在于所述載體板為PVC板。

3.如權利要求1所述的弓形蟲IgM與IgG抗體聯合檢測試劑條的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

1)制備弓形蟲重組抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7：采用基因克隆技術，PCR擴增編碼弓形蟲抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表達，得弓形蟲重組抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7；

2)硝酸纖維素膜的點樣：在硝酸纖維素膜上的弓形蟲IgG抗體檢測線處包被抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體，在硝酸纖維素膜上的弓形蟲IgM抗體檢測線處包被抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體，在硝酸纖維素膜上的對照線處包被羊抗弓形蟲抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7的IgG抗體，晾干；

3)制備膠體金：采用檸檬酸三鈉還原方法制備25nm膠體金，取1％氯金酸1mL加入到100mL去離子雙蒸水中，得到的氯金酸濃度為0.01％，置于帶冷凝裝置的燒瓶中加熱至沸騰，磁力加熱攪拌下加入1％檸檬酸三鈉水溶液2.0mL，繼續加熱直至溶液呈葡萄酒色為止，冷卻后置于棕色瓶中4℃冰箱保存備用；

4)膠體金與弓形蟲抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7的標記：

(1)膠體金與弓形蟲抗原SAG1(P30)的標記：取膠體金10ml，用0.1mol/L?NaOH調至pH5.4，加100μg?SAG1(P30)，混勻，放置5min，加入5％BSA?1ml混勻，4℃、10000r/min離心1h，棄上清，將沉淀用TBS緩沖液溶解至10ml，4℃、10000r/min離心1h，棄上清，沉淀用TBS稀釋至1ml，得膠體金標記的SAG1(P30)抗原；

(2)膠體金與弓形蟲抗原SAG2(P22)、ROP2和GRA7的標記方法與步驟(1)相同，得膠體金標記的SAG2(P22)、ROP2和GRA7抗原；

(3)將膠體金標記的SAG1(P30)抗原、膠體金標記SAG2(P22)、ROP2和GRA7抗原混合后，均勻地涂于玻璃纖維膜上，烘干，制備成膠體金墊；

5)制備弓形蟲IgM與IgG抗體聯合檢測試劑條：

將加樣墊、膠體金墊、硝酸纖維膜和吸收墊依次粘貼在載體板上表面，加樣墊的一端設在膠體金墊的一端上，膠體金墊的另一端設在硝酸纖維膜的一端上，吸收墊的一端設在硝酸纖維膜的另一端上，弓形蟲IgG抗體檢測線、弓形蟲IgM抗體檢測線和對照線依次設在硝酸纖維膜上；在弓形蟲IgG抗體檢測線處包被抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體，在弓形蟲IgM抗體檢測線處包被抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體，在對照線處包被羊抗弓形蟲抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7的IgG抗體，用切條機切成條狀，得弓形蟲IgM與IgG抗體聯合檢測試劑條。

4.如權利要求3所述的弓形蟲IgM與IgG抗體聯合檢測試劑條的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體、抗人IgM特異性片段μ鏈單克隆抗體的濃度為1～4mg/mL。

5.如權利要求3所述的弓形蟲IgM與IgG抗體聯合檢測試劑條的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述羊抗弓形蟲抗原SAG1(P30)、SAG2(P22)、ROP2和GRA7的IgG抗體由抗SAG1(P30)-IgG抗體、抗SAG2(P22)-IgG抗體、抗ROP2-IgG抗體與抗GRA7-IgG按體積比1∶1∶1∶1混合，其終濃度為1～4mg/mL；四者點樣量為1μL/cm。