[發(fā)明專利]一種酶聯(lián)檢測試劑盒及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110277681.2
• 申請日: 2011-09-19
• 公開（公告）號: CN102426240A
• 公開（公告）日: 2012-04-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄒檢平
• 申請（專利權(quán)）人: 北京華創(chuàng)遠(yuǎn)航科技有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/531
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種檢測人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）的酶聯(lián)檢測試劑盒。

本發(fā)明還涉及上述試劑盒的制備方法。

背景技術(shù)

腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移是多階段的、復(fù)雜的、具有高度選擇性的過程，涉及腫瘤細(xì)胞與宿主之間錯綜復(fù)雜的關(guān)系，其機(jī)理尚不甚清楚。近年來關(guān)于新的血管生成與腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后關(guān)系的研究進(jìn)展迅速，證明新的血管生成是腫瘤生成、轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移灶生長的必要條件，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）是調(diào)節(jié)新血管生成的最重要的細(xì)胞因子。研究表明血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）在血管系統(tǒng)的發(fā)育分化中具有不可替代的作用（Ferrara?et?al.?Endocr.?Rev.1997,18:4-25）。

VEGF是一個分子量為45KD的高度糖基化的堿性蛋白，有兩個相同亞單位通過二硫鍵結(jié)合形成，等電點(diǎn)為8.5，有很強(qiáng)的耐熱和耐酸能力。人VEGF基因有5種不同的異構(gòu)體，分別為VEGF206、VEGF189、VEGF165、VEGF145、VEGF121。

VEGF高親和力結(jié)合位點(diǎn)僅位于血管內(nèi)皮細(xì)胞上的3種VEGF受體，即VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3，這3種受體主要分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，均是跨膜受體。研究表明，VEGF受體在體外與VEGF有高度的親和力（Kendall?et?al.?PNAS?USA,?1993,?90:?10705-9）。

VEGF是癌癥生長、轉(zhuǎn)移所必需的一種因子。目前研究表明，在人類各種惡性腫瘤（即癌癥）疾病中，VEGF的分泌增加有著普遍性和廣泛性。有大量文獻(xiàn)報道，VEGF在正常人和癌癥患者中的濃度明顯不同，正常人中的VEGF濃度很低或檢測不到，而在癌癥患者中VEGF濃度很高。因此，檢測人血液中的VEGF濃度，能夠用于癌癥的早期普查診斷。另一方面，VEGF在人體血液中的濃度隨腫瘤的消長情況而變化。腫塊大、生長快時，VEGF的血液濃度就高；而當(dāng)腫瘤因化療或手術(shù)“臨床治愈”時，VEGF的血液濃度降低。故VEGF得檢測可作為療效觀察和預(yù)后的指標(biāo)。VEGF是惡性腫瘤診斷中的一個重要組成部分。另外，血液VEGF水平增高亦見于糖尿病、血管炎癥性疾病、某些免疫性疾病和妊娠等。

Yeo?et?al.(Clin.?Chem.?1992,?38:71)報道了以免疫熒光為基礎(chǔ)的檢測VEGF的ELISA方法，但其檢測靈敏度較低。Houck?et?al.(J?Biol.?Chem.?1992,?267:26031)報道了以比色發(fā)為基礎(chǔ)的檢測VEGF的ELISA方法，但其檢測敏感度僅為?ng/ml。?Hanatani?et?al.?(Biosci.?Biotechnol.?Biochem.?1995,?59:1985)報道了測定VEGF的化學(xué)發(fā)光ELISA，測定正常人的血清VEGF水平為8-36?ng/l。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種酶聯(lián)免疫檢測人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）的檢測試劑盒。該試劑盒結(jié)果準(zhǔn)確穩(wěn)定、特異性強(qiáng)、靈敏度高、使用方便、便于推廣。

本發(fā)明的另一目的是提供上述酶聯(lián)檢測試劑盒的生產(chǎn)制備及使用方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的試劑盒組成為：

1.?酶聯(lián)板；2.?陽性對照（凍干）；3.?陰性對照（凍干）；4.?樣品稀釋液；5.?酶聯(lián)物；6.?濃縮洗滌液；7.?顯色劑A＆B；8.?終止液；9.?封板膠紙。

本發(fā)明提供的上述試劑盒的制備方法及操做步驟如下：

（a）以酶聯(lián)反應(yīng)板為固體支持物，將基因工程表達(dá)的VEGF受體及單克隆抗體包被于固體支持物上；

（b）用封閉液封閉；

（c）將生物標(biāo)本與固定于酶聯(lián)板上的VEGF受體及單克隆抗體接觸和保溫，生物標(biāo)本中的VEGF特異地與VEGF受體及單克隆抗體結(jié)合；

（d）從VEGF受體及單克隆抗體上分離生物標(biāo)本；

（e）用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的VEGF單克隆抗體檢測VEGF，所用顯色底物為3，3＇,5?,5＇-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）。

本發(fā)明試劑盒的獨(dú)特性在于，它使用VEGF受體及單克隆抗體聯(lián)合包被酶聯(lián)板，能夠確保較低水平的VEGF能被本試劑盒所檢測，能對標(biāo)本有更準(zhǔn)確的測定。

本試劑盒檢測生物標(biāo)本中的VEGF，優(yōu)選來自癌癥、血管病病人或其他疾病病人的標(biāo)本。

具體實施方式

下述實施例是為了更詳細(xì)的解釋本發(fā)明，但不應(yīng)理解為本發(fā)明局限于此。

實施例1：