[發明專利]原核表達并純化重組人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)的簡便化工業技術

無效

• 申請號: 201110274434.7
• 申請日: 2011-09-16
• 公開（公告）號: CN102344931A
• 公開（公告）日: 2012-02-08
• 發明（設計）人: 柴笑梅;朱月珍;楊宣武;吳咪佳
• 申請（專利權）人: 江蘇普羅賽生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C07K14/52;C07K1/36;C07K1/22;C07K1/18;C07K1/16;C12R1/19
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技術領域

本發明涉及原核表達并純化重組人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)的簡便化方法。

背景技術

粒菌體集落刺激因子(Granulocyte?Colony-Stimulating?Factor，G-CSF)具有促進粒系造血干細胞增殖分化及增強成熟細胞功能的作用。它能夠在骨髓移植中促進中性白細胞的增殖，并對癌癥化療時引起的嚴重的中性粒細胞缺乏癥，以及再生障礙性貧血伴隨的中性白細胞缺乏癥有明顯的療效。

重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)分子在17位包含一個自由半胱氨酸，并含有兩對二硫鍵，即C?S36-Cys和Cys64-Cys，這兩對二硫鍵對于其活性是必須的。然而，hG-CSF的來源是非常有限的，因此在工業中，必須用基因工程的方法來生產它。通常在E.coli中表達重組hG-CSF(rhG-CSF)。由于細菌細胞質中的還原環境會抑制二硫鍵的形成，故含有二硫鍵的蛋白更容易聚集成包涵體。因此必須在還原劑存在的條件下，用高濃度變性劑溶解包涵體，然后再將變性蛋白進行再折疊和氧化，以得到活性蛋白。然而，由于復性過程中聚集體的形成，復性率通常很低，而且必須采用多步后續的純化步驟對復性后的蛋白進行純化，生產效率較低。

發明內容

本發明的目的在于實現重人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)在原核細胞中的大量表達，并通過簡化的復性純化步驟，獲得純度較高的目的蛋白。在工業生產中滿足生產周期短，生產成本低，產量高的總體要求。

本發明通過體外PCR擴增的方法，從人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)的eDNA中擴增得到G-CSF基因，并通過NdeI和EcoRI限制性酶切位點與表達載體pET-28a連接。隨后將質粒轉化入大腸桿菌BL21(DE3)獲得高效表達。

本發明由于在構建G-CSF的表達載體時，表達載體pET-28a本身在5’端帶有6個組氨酸標簽的核苷酸序列，從而使表達的重組蛋白氨基酸序列的5’端也帶有一個6個組氨酸標簽。這使得后續純化實驗中可采用在鎳親和層析柱上復性的方法，一步就可以獲得比較純的有活性的蛋白(純度＞90％)，大大簡化了純化步驟，提高了蛋白的得率。

同時，本發明在設計PCR擴增時的上游引物時，人為的加入了一個煙草花葉病毒蛋白酶(TEV??蛋白酶)酶切位點ENLYFQG??相應的核苷酸序列5’-GAGAACCTGTACTTCCAGGGA-3’。這個酶切位點的存在可以使煙草花葉病毒蛋白酶作用于該蛋白，切除重組蛋白氨基酸序列5’端帶有的6個組氨酸標簽，以獲得天然結構的人粒細胞集落刺激因子蛋白，從而滿足不同用戶的需要。

附圖說明：

圖1是G-CSF誘導表達每小時取樣SDS-PAGE電泳分析結果圖(M為marker；1～5分別為誘導0h，1h，2h，3h和4h取樣)。

圖2是G-CSF鎳親和層析柱上復性SDS-PAGE電泳分析結果圖(M為marker；FT為流穿液；E1～E5為在還原情況下各部分洗脫液；E6～E9為在非還原情況下各部分洗脫液)。

圖3是G-CSF經離子交換層析純化后各部分洗脫液SDS-PAGE電泳分析結果圖(M為marker；FT為流穿液；1～9為在還原情況下各部分洗脫液；10～18為在非還原情況下各部分洗脫液)。

圖4是G-CSF經superdex?75純化峰圖

圖5是G-CSF經superdex?75純化后的SDS-PAGE電泳分析純度結果圖，SDS-PAGE電泳分析驗證獲得的是高純度的蛋白，蛋白純度＞90％。(M為marker；A5～A10為在還原情況下各部分洗脫液；A11～A16為在非還原情況下各部分洗脫液)。

具體實施方式

1、人粒細胞集落刺激因子的原核表達

編碼人來源的G-CSF基因通過NdeI和EcoRI限制性酶切位點與表達載體pET-28a連接。隨后將質粒轉化入大腸桿菌BL21(DE3)。

挑取單克隆并接入含有3mL?LB和終濃度為100μg/ml卡那霉素的培養基中，搖床37℃，250rpm培養約16小時。將上述菌液按1∶100的比例接入含有1000mL?LB和終濃度為100μg/ml卡那霉素的培養基中，搖床37℃，250rpm培養至OD600約為0.6，加入IPTG至終濃度為1mM，誘導4小時之后收菌，離心，4000rpm，20min，棄上清，菌體-80℃保存。

G-CSF誘導表達SDS-PAGE電泳分析結果見附圖1