[發(fā)明專利]一種利用葡萄糖和甘油混合碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110274326.X
• 申請日: 2011-09-16
• 公開（公告）號: CN102352386A
• 公開（公告）日: 2012-02-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 毛忠貴;陳旭升;張建華;李樹;唐蕾;張宏建
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12P13/02
• 分類號: C12P13/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用葡萄糖和甘油混合碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的方法，具體地說是指通過pH值控制和流加發(fā)酵的方法，利用葡萄糖和甘油共同作碳源高效發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸，屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

ε-聚賴氨酸(ε-PL)一般是由25～35個L-賴氨酸的α-COOH和ε-NH2相互縮合而形成的L-賴氨酸聚合物，分子量在3500～4500Da。ε-PL只能由微生物合成，且ε-PL產(chǎn)生菌僅分布于鏈霉菌屬和北里孢菌屬。目前，ε-PL主要作為食品防腐劑，廣泛用于淀粉質(zhì)類食品防腐。ε-PL作為一種新型食品防腐劑，相比于傳統(tǒng)化學(xué)防腐劑和生物防腐劑，具有更廣的抑菌譜(有效抑制G+、G-、酵母菌和霉菌等)、更好的水溶性、更強的熱穩(wěn)定性(100℃，30min或120℃，20min)和更廣的pH適用范圍(等電點為pH9.0左右)等；同時，ε-PL的添加不會影響食品風(fēng)味。更為重要的是，ε-PL具有較高的安全性：ADME(Absorption，Distribution，Metabolism?and?Excretion)實驗證實ε-PL很難被生物體的腸胃吸收且急性口服劑量達(dá)5g/kg。因此，ε-PL是一種安全、高效的新型生物防腐劑。事實上，ε-PL早在1980s即被日本允許作為食品防腐劑使用；隨后，韓國也批準(zhǔn)ε-PL在食品中添加；2003年，ε-PL獲得美國FDA認(rèn)證(GRN000135)，并開始進(jìn)入美國和歐洲市場。另外，ε-PL作為高分子聚合物前體，具有較高的生物相容性和特異陽離子性，被廣泛用作生物可降解材料、乳化劑、高吸收性水凝膠、藥物載體、抗癌增進(jìn)劑和生物芯片外被等領(lǐng)域研究和應(yīng)用。因此，ε-PL具有廣闊的市場應(yīng)用前景。然而，國際上只有日本窒素公司(Chisso?Corporation)實現(xiàn)了ε-PL工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)且已形成年產(chǎn)千噸級的規(guī)模。ε-PL在國內(nèi)的研究，大多處在實驗室和中試開發(fā)階段且發(fā)酵水平較日本差距較大。所以，建立ε-PL高效發(fā)酵工藝提高ε-PL發(fā)酵產(chǎn)量和生產(chǎn)強度，對于建立我國ε-PL產(chǎn)業(yè)具有重要意義。?

葡萄糖是發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL普遍采用的碳源。巖田敏治等人(CN?1260004A)利用改造后的小白鏈霉菌lysinopolymerus亞種11011A-1(FERM?BP-1109)轉(zhuǎn)化葡萄糖合成大量ε-PL。徐虹等人(CN?101509021A)利用細(xì)胞固定化方法培養(yǎng)北里孢菌PL6-3，以葡萄糖作碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL。賈士儒等人(CN?101671703A)利用葡萄糖作碳源并流加L-賴氨酸發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL。雖然ε-PL產(chǎn)生菌能夠快速利用葡萄糖合成菌體和ε-PL，但ε-PL產(chǎn)量和底物轉(zhuǎn)化率不高，并且在補料階段由于葡萄糖溶解度以及流加方式的限制，會引起發(fā)酵液稀釋并導(dǎo)致ε-PL濃度降低，從而增加了后提取成本和廢水處理負(fù)荷，最終引起ε-PL生產(chǎn)成本的增加。?

最近，我們提出了利用工業(yè)甘油作碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL的方法(201110250123.7)。該方法與以葡萄糖作碳源相比，盡管顯著提高了ε-PL發(fā)酵產(chǎn)量和底物轉(zhuǎn)化率，但發(fā)酵時間較長，從而導(dǎo)致生產(chǎn)強度較低。?

葡萄糖和甘油都是ε-PL產(chǎn)生菌最適碳源(Shima?S，Sakai?H.Agric?Biol?Chem?1981，45：2497-2502)。以葡萄糖為唯一碳源時，ε-PL產(chǎn)生菌的發(fā)酵速度快，但ε-PL產(chǎn)量低，葡萄糖轉(zhuǎn)化率低。以甘油為唯一碳源時，轉(zhuǎn)化率高，ε-PL產(chǎn)量高，但發(fā)酵速度慢。然而，我們研究發(fā)現(xiàn)簡單的將葡萄糖和甘油混合共同作為碳源用于ε-PL發(fā)酵卻并不能有效提高ε-PL發(fā)酵水平。其關(guān)鍵在于，如何確定最合適的葡萄糖和甘油混合比例？如何保證發(fā)酵中后期的葡萄糖和甘油比例維持在最佳水平以及如何控制發(fā)酵過程合適pH值？基于此，本發(fā)明在考察了葡萄糖和甘油混合比例的基礎(chǔ)上，結(jié)合葡萄糖和甘油流加策略保持發(fā)酵中后期總碳源濃度維持在較低水平的方法以及pH值控制策略，建立了一種利用葡萄糖和甘油混合碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的方法。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的主要目的是提供一種利用葡萄糖和甘油混合碳源發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的方法，提高ε-PL發(fā)酵產(chǎn)量和生產(chǎn)強度，從而降低生產(chǎn)成本。?

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：?

利用ε-PL產(chǎn)生菌培養(yǎng)20～30h的種子液，接種葡萄糖和甘油混合碳源的培養(yǎng)基，在初始pH?6.5～7.0、溫度為28～32℃、溶氧保持在15～40％的培養(yǎng)條件下，采用pH值調(diào)控策略和流加發(fā)酵方法生產(chǎn)ε-PL。?