[發(fā)明專利]一種牛血清白蛋白非標記質(zhì)譜定性、定量檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110271790.3
• 申請日: 2011-09-14
• 公開（公告）號: CN102435680A
• 公開（公告）日: 2012-05-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王珊珊;趙汝松;苑金鵬;趙金;張莉莉;李磊
• 申請（專利權(quán)）人: 山東省分析測試中心
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N27/62
• 代理公司: 濟南圣達知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221
• 代理人: 楊琪

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明提供了一種牛血清白蛋白非標記質(zhì)譜定性、定量檢測方法。

背景技術(shù)

質(zhì)譜法是目前用于蛋白質(zhì)高效準確檢測的一種新技術(shù)新方法，其檢測靈敏度和準確度高，可同時獲得定性定量的結(jié)果，還可用于多種蛋白的同時測定。近年來質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展很快。隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域也越來越廣。由于質(zhì)譜分析具有靈敏度高，樣品用量少，分析速度快，分離和鑒定同時進行等優(yōu)點，因此，質(zhì)譜技術(shù)廣泛的應(yīng)用于化學(xué)，化工，環(huán)境，能源，醫(yī)藥，運動醫(yī)學(xué)，刑偵科學(xué)，生命科學(xué)，材料科學(xué)等各個領(lǐng)域。

目前，蛋白質(zhì)組研究的實驗技術(shù)流程一般為樣品(蛋白混合物)經(jīng)二維凝膠電泳，染色，膠上蛋白酶切，進入質(zhì)譜鑒定；或樣品(蛋白混合物)直接經(jīng)酶切，色譜分離，進入質(zhì)譜進行鑒定。在二維凝膠電泳的實驗中，可以通過比較染色后的2張2DE-gel圖像中蛋白點的光密度值進行差異定量，或比較同種蛋白經(jīng)同位素標記和未經(jīng)標記的串聯(lián)質(zhì)譜峰面積進行差異定量。但這兩種常用技術(shù)由于在樣品處理上費時費力，不利于大規(guī)模的蛋白質(zhì)組定量。因此，興起了無標記的質(zhì)譜定量方法，這種方法只需分析大規(guī)模鑒定蛋白時所產(chǎn)生的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，用蛋白相應(yīng)肽段的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行定量，因此，非標記定量技術(shù)在定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究中受到了眾多科學(xué)工作者的推崇。

非標記蛋白定量檢測技術(shù)的優(yōu)勢：

1、無需昂貴的同位素標簽做內(nèi)部標準，實驗耗費低。

2、對樣本的操作也最少，從而使其最接近原始狀態(tài)，并且不受樣品條件的限制，克服了標記定量技術(shù)在對多個樣本進行定量方面的缺陷。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種牛血清白蛋白非標記質(zhì)譜定性、定量檢測方法。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種牛血清白蛋白非標記質(zhì)譜定性、定量檢測方法，步驟如下：

(1)蛋白的酶解：將50μg待檢測的蛋白樣品溶于8.34μL含有尿素、DTT和NH₄HC0₃的水溶液中，置于37℃水浴中還原4h，然后加入0.84μL碘乙酰胺溶液，放置暗處1h，進行烷基化，再加58.34μL?NH₄HCO₃溶液稀釋尿素，最后加入1μg胰蛋白酶，37℃保溫反應(yīng)16h，反應(yīng)結(jié)束后，冷凍干燥成粉末備用；

所述含有尿素、DTT和NH₄HCO₃的水溶液中，含有尿素、DTT和NH₄HCO₃的水溶液中，尿素的濃度為8M，DTT的濃度為10mM，NH₄HCO₃的濃度為50mM；

所述碘乙酰胺溶液中碘乙酰胺的濃度為0.5M；

所述NH₄HCO₃溶液的濃度為50mM；

(2)液相色譜檢測：對上述蛋白的酶解產(chǎn)物進行液相色譜檢測，蛋白酶解產(chǎn)物的進樣量不低于100ng(進樣時，進樣濃度范圍為0.1mg/mL～5mg/mL)，液相的梯度條件為：0-5min，B相保持5％；5-45min，B相從5％升至45％；45-50min，B相從45％升至95％；50-55min，B相從95％降至5％，柱后平衡10min；流速為0.2-0.6mL/min；

(3)定性檢測：定性檢測的肽段為：HLVDEPQNLIK，檢測蛋白的酶解產(chǎn)物中是否含有該肽段，若有，則證明待檢測的蛋白樣品為牛血清白蛋白，若沒有，則證明待檢測的蛋白樣品不是牛血清白蛋白；

(4)定量檢測：定量檢測的肽段為：ATEEQLK，檢測蛋白的酶解產(chǎn)物中該肽段的濃度，通過以下公式計算得出牛血清白蛋白的濃度：在蛋白濃度為10μg/mL-500μg/mL的線性范圍內(nèi)，該肽段的濃度與豐度線性方程為：y＝51925x-491814，R₂＝0.9991，其中，x：牛血清白蛋白的濃度，y：肽段ATEEQLK的豐度。

所述步驟(2)中，選用Agilent-1200色譜系統(tǒng)，流動相A為含0.1％(體積百分數(shù))甲酸的水溶液，B為含0.1％(體積百分數(shù))甲酸的乙腈溶液；分析柱為Agilent?Poroshell?120SB-C18色譜柱，規(guī)格為3.0mm×150mm，粒徑2.7μm。