[發明專利]一種牛血清白蛋白非標記質譜定性、定量檢測方法

有效

• 申請號: 201110271790.3
• 申請日: 2011-09-14
• 公開（公告）號: CN102435680A
• 公開（公告）日: 2012-05-02
• 發明（設計）人: 王珊珊;趙汝松;苑金鵬;趙金;張莉莉;李磊
• 申請（專利權）人: 山東省分析測試中心
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N27/62
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 楊琪

1.一種牛血清白蛋白非標記質譜定性、定量檢測方法，其特征在于，步驟如下：(1)蛋白的酶解：將50μg待檢測的蛋白樣品溶于8.34μL含有尿素、DTT和NH₄HC0₃的水溶液中，置于37℃水浴中還原4h，然后加入0.84μL碘乙酰胺溶液，放置暗處1h，再加58.34μL?NH₄HCO₃溶液，最后加入1μg胰蛋白酶，37℃保溫反應16h，反應結束后，冷凍干燥成粉末備用；

所述含有尿素、DTT和NH₄HCO₃的水溶液中，含有尿素、DTT和NH₄HCO₃的水溶液中，尿素的濃度為8M，DTT的濃度為10mM，NH₄HCO₃的濃度為50mM；

所述碘乙酰胺溶液中碘乙酰胺的濃度為0.5M；

所述NH₄HCO₃溶液的濃度為50mM；

(2)液相色譜檢測：對上述蛋白的酶解產物進行液相色譜檢測，蛋白酶解產物的進樣量不低于100ng，液相的梯度條件為：0-5min，B相保持5％；5-45min，B相從5％升至45％；45-50min，B相從45％升至95％；50-55min，B相從95％降至5％，柱后平衡10min；流速為0.2-0.6mL/min；

(3)定性檢測：定性檢測的肽段為：HLVDEPQNLIK，檢測蛋白的酶解產物中是否含有該肽段，若有，則證明待檢測的蛋白樣品為牛血清白蛋白，若沒有，則證明待檢測的蛋白樣品不是牛血清白蛋白；

(4)定量檢測：定量檢測的肽段為：ATEEQLK，檢測蛋白的酶解產物中該肽段的濃度，通過以下公式計算得出牛血清白蛋白的濃度：在蛋白濃度為10μg/mL-500μg/mL的線性范圍內，該肽段的濃度與豐度線性方程為：y＝51925x-491814，R₂＝0.9991，其中，x：牛血清白蛋白的濃度，y：肽段ATEEQLK的豐度。

2.根據權利要求1所述的一種牛血清白蛋白非標記質譜定性、定量檢測方法，其特征在于：所述步驟(2)中，選用Agilent-1200色譜系統，流動相A為含0.1％甲酸的水溶液，B為含0.1％甲酸的乙腈溶液；分析柱為Agilent?Poroshell?120SB-C18色譜柱，規格為3.0mm×150mm，粒徑2.7μm。

3.根據權利要求1所述的一種牛血清白蛋白非標記質譜定性、定量檢測方法，其特征在于：所述步驟(3)、(4)中，檢測肽段所用的質譜條件為：離子源：ESI源，采用正離子模式檢測，四極桿溫度：100℃，毛細管電壓：4000?V,霧化壓力：40psig，Fragmentor：175V，干燥氣溫度：350℃，干燥氣流速：10L/min，掃描模式：Scan，質量掃描范圍200-2000m/z。

4.根據權利要求1所述的一種牛血清白蛋白非標記質譜定性、定量檢測方法，其特征在于：所述步驟(2)中，流速為0.2mL/min。