[發明專利]抑制血管生成相關基因序列

無效

• 申請號: 201110270641.5
• 申請日: 2011-08-31
• 公開（公告）號: CN102409056A
• 公開（公告）日: 2012-04-11
• 發明（設計）人: 張愛聯;張澤華;沈錦城;張添元;羅進賢
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所;海南金寶正誠礦業有限公司
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C07K14/47;A61K38/17;A61P9/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及分子生物學中的基因領域，是關于抑制血管生成活性相關的基因序列。

背景技術

正常成年人血管內皮細胞的增殖處于靜止狀態，沒有新的血管生成。但是，在某些病理情況下，血管內皮細胞的增殖處于靜止的狀態被打破則血管內皮細胞增殖、新的血管生成。

至今尚沒有有效的抑制血管新生的化學藥物。血管生成抑制因子是一類特異性抑制血管內皮細胞增殖的藥物，不產生抗藥性和毒性。研究血管生成抑制因子治療血管新生是當前的研究熱點。

發明內容

本發明的目的是提供一種抑制血管生成的新的基因序列。是通過DNA序列合成方法合成一段DNA序列，將這段DNA序列重組于畢赤酵母中表達，表達產物活性分析證明具有抑制血管內皮細胞增殖和抑制新的血管生成的活性。其核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO.1所述；它的氨基酸序列如序列表中SEQ?ID?NO.2所述。

本發明的目的通過以下技術措施實現：

1.DNA序列的合成。

設計如下DNA序列，并用套疊PCR方法進行其序列合成。將其序列命名為scl。

ATGCACGGAGACTCAGAATACAACATCATGTTTGGTCCCGACATCTGTGGCCCTGGCAC?CAAGAAGGTTCATGTCATCTTCAACTACAAGGGCAAGAACGTGCTGATCAACAAGGACA?TCCGTTGCAAGGATGATGAGTTTACACACCTTACACTGATTGTGCGGCCAGACAACCAT?CATCATCATCATCATTAG

2.DNA序列編碼蛋白功能的證明

(1)DNA序列重組于酵母中表達

通過DNA內切酶和T4DNA連接酶的作用，將以上合成的DNA片段插入畢赤酵母表達載體pPIC9K的多克隆位點，將其表達載體命名為pPIC9K-scl(附圖1)。用電轉法將pPIC9K-scl轉化畢赤酵母GS115，獲得工程菌GS115(pPIC9K-scl)。用BMGY-BMMY發酵GS115(pPICP9K-scl)誘導表達Scl蛋白。

(2)表達產物活性分析

發酵液上清過Ni-Agarose?His標簽蛋白純化柱進行純化(附圖2)，收獲的含目標蛋白的液體經過抽濾除鹽后，進行抑制人臍靜脈血管內皮細胞增殖和抑制雞胚絨毛尿囊膜血管生成試驗。結果是Scl蛋白誘發人血管內皮細胞凋亡(附圖3)，抑制雞胚絨毛尿囊新生血管生成，其對雞胚絨毛尿囊膜血管生成的抑制作用強于Angiostatin(附圖4)。這些結果表明scl基因編碼的蛋白具有抑制血管內皮細胞增殖和抑制新生血管生成的活性，scl是抑制血管生成相關基因序列。

本發明的優點：

血管生成抑制因子在治療血管增生性疾病中有著重要的用途。雖然已發現的血管生成抑制因子有多種，但是本發明的血管生成抑制因子基因序列小，分子量小的藥物有利于在機體內的傳輸，并且Scl蛋白抑制血管生成的作用較強。

附圖說明

附圖1.構建含scl基因的畢赤酵母表達載體

附圖2.純化重組Scl蛋白

M.蛋白Marker；2.純化的重組Scl蛋白。

附圖3.Scl蛋白誘發血管內皮細胞凋亡試驗

a.PBS????b.Scl

附圖4.Scl蛋白抑制雞胚絨毛尿囊膜新血管生成試驗

a.PBS；b.Scl；c.Angiostatin

具體實施方式

1.DNA序列的合成。

(1)設計如下DNA序列。

ATGCACGGAGACTCAGAATACAACATCATGTTTGGTCCCGACATCTGTGGCCCTGGCAC?CAAGAAGGTTCATGTCATCTTCAACTACAAGGGCAAGAACGTGCTGATCAACAAGGACA?TCCGTTGCAAGGATGATGAGTTTACACACCTTACACTGATTGTGCGGCCAGACAACCAT?CATCATCATCATCATTAG

(2)合成如下引物：

p1.

5’ATGCACGGAGACTCAGAATACAACATCATGTTTGGTCCCGACATCTGTGGCCCTGGCA

C3’

p2.