[發明專利]一種檢測結核菌蛋白抗原的試劑盒及其制備方法

有效

• 申請號: 201110262154.4
• 申請日: 2011-09-06
• 公開（公告）號: CN102426232A
• 公開（公告）日: 2012-04-25
• 發明（設計）人: 李曉彤;于占嬌;楊赟
• 申請（專利權）人: 廈門大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/558;G01N21/31
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所 35200
• 代理人: 馬應森

1.一種檢測結核菌蛋白抗原的試劑盒，其特征在于設有盒體、PBST洗液瓶、四甲基聯苯胺顯色液瓶、CFP10-ESAT6蛋白標準樣品瓶、PPD蛋白標準樣品瓶、樣品稀釋液瓶、聚苯乙烯酶聯檢測板、終止液瓶、酶標二抗瓶和上層檢測抗體瓶；所述PBST洗液瓶、四甲基聯苯胺顯色液瓶、CFP10-ESAT6蛋白標準樣品瓶、PPD蛋白標準樣品瓶、樣品稀釋液瓶、聚苯乙烯酶聯檢測板、終止液瓶、酶標二抗瓶和上層檢測抗體瓶設在盒體內；所述四甲基聯苯胺顯色液瓶包括顯色A液瓶和顯色B液瓶；所述顯色A液的組成為：液醋酸鈉(CH₃COONa)0.272g，檸檬酸(C₆H₈O₇·H₂O)0.032g，雙氧水(H₂O₂?30％)6μl，蒸餾水加至10ml；所述顯色B液的組成為：乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)0.004g，檸檬酸(C₆H₈O₇·H₂O)0.019g，甘油(C₃H₈O₃)1ml，四甲基聯苯胺(TMB)0.004g，蒸餾水加至10ml；所述上層檢測抗體瓶包括CFP10-ESAT6多克隆抗體瓶和陽性抗結核菌體多克隆抗體瓶；所述終止液為2MH₂SO₄終止液。

2.如權利要求1所述的一種檢測結核菌蛋白抗原的試劑盒，其特征在于所述聚苯乙烯酶聯檢測板采用真空包裝的聚苯乙烯酶聯檢測板。

3.如權利要求1所述的一種檢測結核菌蛋白抗原的試劑盒，其特征在于所述2M?H₂SO₄終止液瓶采用20ml/支。

4.如權利要求1所述的一種檢測結核菌蛋白抗原的試劑盒，其特征在于所述酶標二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠抗體，20μl/支分裝。

5.如權利要求1所述的一種檢測結核菌蛋白抗原的試劑盒的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

1)配制實驗試劑

(1)包被液：0.1M碳酸鹽緩沖液，pH?9.6，所述碳酸鹽緩沖液的組成為：碳酸鈉0.0318g，碳酸氫鈉0.0586g，蒸餾水加至20ml；

(2)磷酸鹽緩沖液：10×濃縮，所述磷酸鹽緩沖液的組成為：氯化鈉16g，氯化鉀0.4g，磷酸二氫鉀0.48g，磷酸氫二鈉7.16g，蒸餾水加至200ml，用HCL/NaOH調pH至7.4；

(3)封閉液：2％BSA/PBS，所述封閉液的組成為：正常牛血清白蛋白0.5g，1×PBS25ml；

(4)樣品稀釋液：0.2％BSA/PBS，所述樣品稀釋液的組成為：2％BSA/PBS2ml，蒸餾水加置20ml；

(5)PBST洗液：所述PBST洗液的組成為：10×PBS100ml，吐溫-200.5ml，蒸餾水加至1000ml：

(6)辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG，20μl/支分裝；

(7)顯色A液：所述顯色A液的組成為：液醋酸鈉0.272g，檸檬酸0.032g，雙氧水6μl，蒸餾水加至10ml；

(8)顯色B液：所述顯色B液的組成為：乙二胺四乙酸二鈉0.004g，檸檬酸0.019g，甘油1ml，四甲基聯苯胺0.004g，蒸餾水加至10ml；

(9)2M?H₂SO₄終止液：取H₂SO₄?1.105ml，加入到18.92ml的水中，混勻即可；

2)捕獲抗體：CFP10-ESAT6單克隆抗體的包被

將捕獲抗體用包被液稀釋至2～4μg/ml，按50～100μl/孔的體積加入聚苯乙烯酶聯檢測板中，4℃過夜或37℃孵育2～4h后，用PBST洗液洗滌3～5次，拍干；

3)聚苯乙烯酶聯檢測板的封閉與保存

將步驟2)中拍干后的聚苯乙烯酶聯檢測板上的每孔加200μl或加滿封閉液，37℃孵育1～2h后，用PBST洗液洗滌3～5次，拍干，真空包裝后保存于4℃冰箱；

4)制備試劑盒其它試劑樣品

(1)制備CFP10-ESAT6蛋白標準樣品和PPD蛋白標準樣品：將CFP10-ESAT6蛋白用PBS稀釋成2000～4000ng/ml，PPD蛋白用PBS稀釋成2000～4000ng/ml，300μl/支分裝；

(2)制備上層檢測抗體：上層檢測抗體包括CFP10-ESAT6多克隆抗體和陽性抗結核菌體多克隆抗體，20μl/支分裝。