[發明專利]七帶石斑魚精子冷凍保存和應用方法無效

申請號：	201110261862.6	申請日：	2011-09-06
公開（公告）號：	CN102273439A	公開（公告）日：	2011-12-14
發明（設計）人：	田永勝;齊文山;陳松林;翟介明;汪娣	申請（專利權）人：	中國水產科學研究院黃海水產研究所
主分類號：	A01N1/02	分類號：	A01N1/02;A01K61/00
代理公司：	北京中偉智信專利商標代理事務所 11325	代理人：	張岱
地址：	266071 山***	國省代碼：	山東;37
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摘要：
搜索關鍵詞：	石斑魚精子冷凍保存應用方法
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【說明書】：

技術領域：

本發明屬于魚類低溫生物學及種質超低溫冷凍保存技術領域，是一種在超低溫狀態(-196℃)下大量冷凍保存魚類精子并在生產中應用的技術方法。

背景技術：

七帶石斑魚(Epinephelus?septemfasciatus)是分布在我國黃海和東海海域一種名貴魚類，近年隨著養殖技術的不斷提高，被人工馴化為海水工廠化養殖的優良品種。由于具有“冷水石斑”之稱，是北方養殖石斑魚的首選品種。七帶石斑魚和大部分石斑魚一樣都屬于雌雄同體，雌性先熟魚類。七帶石斑魚體重大于6kg時，才開始性轉化為雄魚，親本群體中雌性數量多而雄性相當少，極大的限制了七帶石斑魚的人工繁殖、苗種大量培育和大規模養殖推廣。近年來有人利用飼喂甲基睪酮或埋植甲基睪酮緩釋膠囊的方式，促使雌性盡早發生性轉化(日本三重縣水產研究所，水産增殖，土橋靖史等，2003)，但是通過人工促使轉化的雄魚產精量也相當少，每尾魚一次能產0.5-1ml精液，對于大量成熟的卵子也難于滿足受精的要求。

魚類精子冷凍保存技術作為長期保存魚類種質的一種方法，在防止魚類品種滅絕、魚類自然種群的恢復，具有地理和時間隔離的魚類種群之間的雜交育種，基于家系建立的選擇育種，雌核發育誘導及人工繁殖育苗等方面都具有重要的應用潛力。在鱸形目魚類精子冷凍保存方面，陳松林等對花鱸精子進行了冷凍保存研究(中國水產科學研究院黃海水產研究所，Aquaculture，Chen?et?al，2004)。區又君等(中國水產科學研究院南海水產研究所，中國南方漁業學術論壇第二十六次水產學術交流論文集，2010)也進行了七帶石斑魚精子冷凍保存實驗，但精子冷凍存活率僅為10％以上，都難于達到生產應用水平。蒙子寧等利用Hank’s溶液做為稀釋液，進行了斜帶石斑魚、鞍帶石斑魚、褐點石斑魚精子冷凍保存(中山大學，蒙子寧等，中華人民共和國國家知識產權局，CN?101874483?A)，但該技術方法不包括對七帶石斑魚精子冷凍保存的研究。

發明內容：

本發明提出一種七帶石斑魚精子大量冷凍保存和應用的方法，以解決七帶石斑魚人工繁殖群體中雄性數量少和產精量少、人工繁殖和苗種培育受到極大限制的問題。

本發明是通過以下技術方法實現的：

一種七帶石斑魚精子冷凍保存方法，包括：精子采集和檢測、精子稀釋液配制、冷凍保存液配制、精子與冷凍保存液混合、平衡和冷凍保存；

所述的精子采集和檢測，優選的七帶石斑魚精子活力在70-80％以上的精液用于冷凍保存；

所述的精子稀釋液配制：在每升蒸餾水中加入葡萄糖60g、NaCl?10g、NaHCO₃?0.5g，配制而成；

所述的冷凍保存液配制，優選的在精子稀釋液中加入10％的二甲基亞砜(DMSO)或10％的1，2-丙二醇，配制而成；

所述的精子與冷凍保存液混合，優選的冷凍保存液與七帶石斑魚精液以1∶1的比例混合，將混合精液1ml注入2ml冷凍管中；

所述的平衡和冷凍保存，優選的在室溫下平衡5min，然后在-60--80℃的液氮蒸氣中平衡10min，之后直接將盛放冷凍管的小布袋投入液氮中冷凍保存。

一種七帶石斑魚精子冷凍保存方法的應用，包括：1)解凍和精子活力檢測、冷凍精子在37℃水浴中解凍，鏡檢冷凍精子活力；2)受精冷凍精子受精比例為1m1冷凍精子：200ml未受精卵。

本發明技術方案與現有技術相比的有益效果：

1、實現了七帶石魚精子大量冷凍保存和應用，利用該方法可以在繁殖前期或后期將成熟精子冷凍保存起來備用，或者從國內其它地方冷凍保存七帶石斑魚的精子，運輸到育苗場。解決了七帶石斑魚人工繁殖中精液量不足的問題。