[發明專利]女性生殖器癌癥相關SNP位點多重檢測方法的建立

無效

• 申請號: 201110257784.2
• 申請日: 2011-09-02
• 公開（公告）號: CN102965427A
• 公開（公告）日: 2013-03-13
• 發明（設計）人: 馬學軍;劉穎;張晨
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

發明領域

本發明屬于生物技術應用領域，涉及正常體檢人群的全血和口腔拭子等標本的6個女性生殖器癌癥相關SNP位點(包括rs4784227、rs12196489、rs3803662、rs889312、rs750749和rs749292)的同時檢測和分型。具體在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/下載SNP位點rs4784227(C＞T)、rs12196489(G＞A)、rs3803662(T＞C)、rs889312(C＞A)、rs750749(T＞C)和rs749292(G＞A)側翼的核苷酸序列，設計各位點適用于T-ARMS-PCR技術的內外特異性引物，對6個SNP位點進行單管多重PCR分型。本專利通過多重嵌合引物PCR技術和毛細管電泳兩項改進，克服了常規單管四引物擴增受阻突變體系PCR不能多重檢測的缺點，其高通量、簡易快速的特點為女性生殖器癌癥相關SNP位點的快速分型提供了新的手段，對研究我國女性生殖器癌癥相關SNP位點的基因型分布和女性生殖器癌癥的預防有重要意義。

發明背景

在人類基因組序列中，單核苷酸多態性(single?nucleotide?polymerphisms，SNPs)是最常見的變異。已有研究表明，SNP位點rs4784227(C＞T)、rs12196489(G＞A)、rs3803662(T＞C)和rs889312(C＞A)與亞裔女性的乳腺癌易感性相關，rs750749(T＞C)是子宮頸癌易感性相關位點，rs749292(G＞A)是卵巢癌易感性相關位點。對這6個位點快速準確的分型有助于女性生殖器癌癥的預防。

在近年來發展出的多種SNP檢測技術中，四引物擴增受阻突變體系PCR(tetra-primer?amplification?refractory?mutation?system?PCR，T-ARMS-PCR)，或兩對交叉引物PCR(PCR?with?confronting?two-pair?primers，PCR-CTPP)因其操作簡便、分型快速、費用低廉已被廣泛應用。其原理為：針對已知的突變，在突變點的兩側分別設計一對外引物和一對特異性內引物，特異性內引物用來檢測突變是否發生，外引物在PCR反應中和特異性內引物分別配對有選擇性地擴增突變型與野生型個體基因；通過使外引物距突變點長度不同可以得到不同長度的特異性擴增片段，根據電泳圖譜中片段大小和有無，可以判斷突變是否發生以及個體的基因型。

目前，T-ARMS-PCR仍以單重檢測為主，少數實驗室也能實現多重檢測(Multiplex-T-ARMS-PCR，M-T-ARMS-PCR)，但其可同時檢測的位點數量難以進一步提高，主要受到兩個限制：多重擴增的偏向性及瓊脂糖電泳的分辨率。本實驗通過引入多重嵌合引物PCR技術對T-ARMS-PCR進行了改進，在擴增初期使用特異性嵌合引物(即在特異性引物5’端引入通用序列)擴增，而擴增末期由通用引物引發擴增，從而在保證反應特異性的同時，降低了多重PCR的偏向性。此外應用分辨率較高的毛細管電泳(capillary?electrophoresis，CE)替代瓊脂糖電泳，建立了單管多重PCR同時檢測女性生殖器癌癥相關位點rs4784227(C＞T)、rs12196489(G＞A)、rs3803662(T＞C)、rs889312(C＞A)、rs750749(T＞C)和rs749292(G＞A)的六位點檢測方法。

發明內容

1.在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/下載SNP位點rs4784227(C＞T)、rs12196489(G＞A)、rs3803662(T＞C)、rs889312(C＞A)、rs750749(T＞C)和rs749292(G＞A)側翼的核苷酸序列，設計適用于T-ARMS-PCR技術的引物。在內引物的3’端倒數第二位(-2位)引入一個人為錯配堿基來提高延伸反應的特異性，并在全部正向引物和反向引物的5’端分別加入一段非同源性序列作為通用引物(Tag-F和Tag-R)。使用Primer?Premier?5.0設計的引物序列如表1：

表1

表1?多重T-ARMS-PCR分型所使用的引物信息