[發(fā)明專利]人的肌紅蛋白(Myoglobin)定量測(cè)定試劑盒及其檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110257770.0
• 申請(qǐng)日: 2011-08-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102435752A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-05-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 不公告發(fā)明人
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 內(nèi)蒙古科慧生物科技有限責(zé)任公司
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N33/531;G01N21/76
• 代理公司: 北京富天民宏濟(jì)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11272
• 代理人: 劉壽椿;龔雅民

1.一種人的肌紅蛋白MYOGLOBIN的定量測(cè)定試劑盒，其特征在于，該試劑盒包含MYOGLOBIN磁分離試劑，酶反應(yīng)物，反應(yīng)增強(qiáng)劑，稀釋液，MYOGLOBIN校準(zhǔn)品、MYOGLOBIN質(zhì)控品，清洗液濃縮液以及底物溶液。

2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的MYOGLOBIN磁分離試劑含有標(biāo)記有抗MYOGLOBIN單克隆抗體的磁性微球；

所述的酶反應(yīng)物是含有堿性磷酸酶標(biāo)記的抗MYOGLOBIN單克隆抗體；

所述的反應(yīng)增強(qiáng)劑是含有Tris的緩沖液；

所述稀釋液是含有BSA的溶液；

所述的校準(zhǔn)品及質(zhì)控品是含有一定量的MYOGLOBIN抗原的BSA溶液；

所述清洗液濃縮液是含有TWEEN-20和Proclin-300的緩沖液；

所述的底物溶液為酶促化學(xué)發(fā)光底物溶液。

3.如權(quán)利要求1-2任其一所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中各組分按照如下制備方法制得：

一、磁分離試劑的制備過(guò)程

一)、磁珠緩沖液配制操作步驟，配制1L：

(1)、稱取TRIS?4.58g和NaCl6.81g于1L容器中，稱取0.96g?TWEEN-20于20ml容器中加適量水使其完全溶解后，倒入上述1L容器中；

(2)、用移液器將Proclin-300量取0.2ml于10ml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中，然后在上述1L容器中加入800ml純化水，充分?jǐn)嚢瑁?/p>

(3)、調(diào)節(jié)PH，控制PH在7.95-8.05之間；

(4)、稱取BSA?3g倒入上述1L容器中；

(5)、最后定容至1000ml，用0.2um濾器過(guò)濾即得；

二)、磁分離試劑的制備過(guò)程

(1)、將1.0mg辛二酸二琥珀酰亞胺酯溶于50ul?DMSO中，取2mg抗MYOGLOBIN單克隆抗體溶于PH?9.5的0.1mol/L?PB緩沖液中至總體積為1ml；

(2)、用移液槍吸取上述辛二酸二琥珀酰亞胺酯加入到步驟1的抗體溶液中，置室溫90min；

(3)、將步驟2的溶液加入到濃縮管中，然后放入到高速冷凍離心機(jī)中在3000g下離心30min濃縮至0.5ml；

(4)、取0.5ml磁珠，加入5ml反應(yīng)杯中，經(jīng)磁鐵吸附2分鐘后吸取上清，然后加入1.5ml?PH9.50.1mol/L?PB，混勻30秒，然后加入步驟3獲得的抗體溶液，混勻后室溫反應(yīng)4小時(shí)；

(5)、加入0.3ml?lmol/L的TRIS溶液37℃15分鐘，然后加入1.5ml?PH?7.20.1mol/L?PB清?洗已經(jīng)標(biāo)記的磁珠，混勻30秒；

(6)、用100ml磁珠保存液將磁珠轉(zhuǎn)入玻璃瓶；

(7)、將步驟6獲得的溶液與上述磁珠緩沖液按照1∶1的體積比例混勻，即得權(quán)利要求1或2所述試劑盒中的磁分離試劑；

二、酶反應(yīng)物的制備過(guò)程

一)、酶反應(yīng)物稀釋液配制操作步驟，配制1L：

(1)、取Tris?6.06g、NaCl?13.0g、Zncl₂?0.05g、Proclin-300?0.2ml和MgCl₂?0.05g于燒瓶中，然后在燒瓶中加入800ml純化水，充分?jǐn)嚢瑁乖噭┩耆芙猓?!-- SIPO -->

(2)、調(diào)PH，控制PH在7.35-7.45范圍內(nèi)；

(3)、稱取BSA?3g倒入上述燒杯中；

(4)、最后定容至1000ml，用0.2um濾器過(guò)濾即得；

二)、堿性磷酸酶ALP與抗MYOGLOBIN單克隆抗體的偶聯(lián)

(1)、取10mgALP加入5ml生理鹽水中，加入到濃縮管中，3000RPM離心20分鐘，濃縮至1毫升；

(2)、向步驟1獲得濃縮液中加入0.2ml的0.1M?NaIO₄溶液，室溫下避光攪拌20分鐘，然后裝入透析袋中，用1mM?PH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過(guò)夜，收集保留液；

(3)、向步驟2獲得保留液中加入0.2M?PH9.5碳酸鹽緩沖液，使PH升高到9.0，然后立即加入2.5mg抗MYOGLOBIN單克隆抗體，攪拌2小時(shí)，再加入0.1ml的4mg/ml?NaBH₄溶液，混勻，置4℃下2小時(shí)；

(4)、將上述溶液裝入透析袋中，用0.15M?PH7.4PBS透析，4℃過(guò)夜，收集保留液；

(5)、向步驟4獲得保留液中逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃1小時(shí)，然后3000rpm離心半小時(shí)，棄上清，沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于20ml的0.15M?PH7.4的PBS中；

(6)、將步驟5獲得的溶液裝入透析袋中，用0.15M?PH7.4的PB緩沖液透析5個(gè)小時(shí)去除銨離子，收集保留液后10，000rpm離心30分鐘去除沉淀，收集上清液，按照體積比為1∶100的比例添加1M?MgCl₂溶液，即得堿性磷酸酶ALP與抗MYOGLOBIN單克隆抗體的偶聯(lián)物；將收集到的堿性磷酸酶ALP與抗MYOGLOBIN單克隆抗體的偶聯(lián)物用上述步驟一)獲得的酶反應(yīng)物稀釋液以1∶1000的體積比混合均勻，即得酶反應(yīng)物。

三、反應(yīng)增強(qiáng)劑的制備過(guò)程，配制1L：

(1)、取TRIS1.56g和NaCl?4.23g于1L容器中，取0.2ml?Proclin-300于10ml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；?

(2)、取800ml純化水于上述1L容器中，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙猓{(diào)PH在7.35-7.45之間；

(3)、稱取Mak330.9g于上述1L容器中；最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um濾器過(guò)濾即得；

四、稀釋液的制備過(guò)程，配制1L：

(1)、稱取NaC19.0g和BSA?60g于1L的容器中；

(2)、取0.5ml?Proclin-300加10ml純化水溶解，倒入上述1L的容器中；

(3)、最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um濾器過(guò)濾即得；

五、MYOGLOBIN校準(zhǔn)品和MYOGLOBIN質(zhì)控品的配制：

MYOGLOBIN校準(zhǔn)品中MYOGLOBIN抗原的濃度分別為5、15、30、80、160ng/ml；MYOGLOBIN質(zhì)控品中MYOGLOBIN抗原的濃度分別為15、80ng/ml；

六、清洗液濃縮液的制備過(guò)程，配制1L：

(1)、取TRIS?12.54g和NaCl?325.6g于1L容器中；

(2)、取5g?Tween-20于100ml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述1L容器中；

(3)、取0.2ml?Proclin-300于盛有10ml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；

(4)、取800ml純化水于上述1L容器中，充分?jǐn)嚢瑁敝镣耆芙猓?/p>

(5)、調(diào)PH，控制其范圍在7.35-7.45之間；

(6)、最后定容1000ml，完全溶解后用0.2um濾器過(guò)濾即得；

七、底物溶液的制備過(guò)程，配制1L：

(1)、取TRIS?2.35g、NaCl?6.41g、Na₂SO₃?0.002g和Proclin-300?0.2ml于1L燒杯中；

(2)、取600ml純化水于1L燒杯中，充分?jǐn)嚢柚敝镣耆芙猓{(diào)PH在7.95-8.05之間；

(3)、加入250ml?Lumi-Phos?480，用0.2um濾器過(guò)濾收集濾液，用純化水定容至1000ml，混勻后即得。