[發(fā)明專利]一種誘導(dǎo)煙草疫霉產(chǎn)生致病性分泌蛋白的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110255064.2
• 申請(qǐng)日: 2011-08-31
• 公開（公告）號(hào): CN102321711A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 羅華元;常壽榮;王紹坤;徐潔;周曉罡
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 紅云紅河煙草（集團(tuán)）有限責(zé)任公司;云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所
• 主分類號(hào): C12P21/00
• 分類號(hào): C12P21/00;C12R1/645
• 代理公司: 昆明正原專利代理有限責(zé)任公司 53100
• 代理人: 金耀生

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種誘導(dǎo)煙草疫霉產(chǎn)生致病性分泌蛋白的方法。

背景技術(shù)

由Phytophthora?parasiticavar.nicotiana?引起的煙草黑脛病是煙草生產(chǎn)上毀滅性病害之一，世界各地的煙草種植區(qū)均有發(fā)生，每年可造成數(shù)百億美元的損失，因此受到世界各國煙草育種學(xué)家、植物病理學(xué)家、遺傳學(xué)家的廣泛關(guān)注。煙草疫霉同時(shí)還是遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的良好實(shí)驗(yàn)材料，該病害系統(tǒng)是真菌-植物互作研究的模式系統(tǒng)，近年來的研究獲得了許多與該病原菌侵染相關(guān)的形態(tài)分化和致病因子的遺傳資源與信息，為煙草疫霉菌基因組學(xué)研究打下了良好基礎(chǔ)。

通過致病相關(guān)基因的功能研究，可深入了解煙草疫霉菌的致病機(jī)制、并以此為途徑尋找煙草中與該病原菌致病基因相對(duì)應(yīng)的抗性基因，研究寄主-病原物互作機(jī)制和抗病機(jī)制，預(yù)測(cè)該病菌群體中致病基因分布、多樣性栽培條件下致病基因的表達(dá)和變化、誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的功能域與致病功能域的關(guān)系，預(yù)測(cè)煙草中相應(yīng)抗病基因的抗性持久性。通過鑒定致病基因控制的致病相關(guān)因子，可以尋找殺菌劑的作用靶點(diǎn)，最終為有效控制煙草黑脛病提出新的策略。但是多年研究結(jié)果表明，目前還沒有能夠誘導(dǎo)煙草疫霉菌產(chǎn)生致病性分泌蛋白的方法，從而無法確定其致病相關(guān)因子，限制了對(duì)其致病機(jī)理的深入研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服煙草疫霉菌在固體培養(yǎng)條件下無法產(chǎn)生分泌蛋白的不足，提供一種能夠誘導(dǎo)煙草疫霉病菌產(chǎn)生致病性分泌蛋白的方法。

??本發(fā)明的誘導(dǎo)煙草疫霉菌產(chǎn)生致病性分泌蛋白的方法是按以下步驟進(jìn)行：

（1）將煙草黑脛病樣用自來水沖洗干凈病株莖稈表面，待風(fēng)干后從病健交界處取0.4cm×0.4cm髓部組織塊置于燕麥培養(yǎng)基，置于28℃黑暗條件下培養(yǎng)3～4天，再接種到燕麥培養(yǎng)基上，置于28℃黑暗條件下培養(yǎng)3～4天；形成較大的菌落；

（2）形成較大的菌落后，將菌絲塊轉(zhuǎn)接到300mL分泌蛋白液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基；分泌蛋白液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基由以下部分組成：酵母浸膏0.5?-1mg/L、葡萄糖?25-30g?/L、NaH₂PO4?0.5－0.75g/L、MgSO4·7H₂O?0.25－0.4g/L、天門冬酰胺?1.5－2g/L、VB1?1.5－2mg/L、H₂O?1L，于28℃，120rpm振蕩培養(yǎng)2周；

（3）用雙層滅菌濾紙濾去菌絲體，濾液經(jīng)5000rpm離心20min，上清液加入100%飽和硫酸銨溶液，于10000?rpm離心30min，沉淀經(jīng)1KD（透析帶截流范圍）透析帶處理，凍干后獲得煙草疫霉致病性分泌蛋白提取物，-20℃保存；

（4）將得到的蛋白提取物用100μl除離子水溶解后，在成株期煙草葉片上進(jìn)行接種實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證所提取蛋白的特性。

本發(fā)明的有益效果是解決了煙草疫霉菌在人工培養(yǎng)條件下不產(chǎn)生致病性分泌蛋白的問題，通過對(duì)液體培養(yǎng)基配方調(diào)整，加入少量無機(jī)鹽及氨基酸，從而誘導(dǎo)煙草疫霉菌大量產(chǎn)生致病性分泌蛋白。通過對(duì)這些分泌蛋白的分離和提純，可以深入研究煙草疫霉與寄主之間在蛋白質(zhì)水平上的相互作用，最終揭示二者在基因水平上的相互識(shí)別、信號(hào)傳導(dǎo)等機(jī)理，對(duì)于煙草黑脛病致病機(jī)理的研究具有重要意義。

具體實(shí)施方式

將分離得到的煙草疫霉菌在燕麥固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)入致病性分泌蛋白液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，最后提取煙草疫霉菌致病性分泌蛋白，蛋白提取物在煙草葉片上接種，調(diào)查壞死斑。

實(shí)施例?1：