[發明專利]利用生物反應器制備豬乙型腦炎滅活疫苗的方法

無效

• 申請號: 201110249517.0
• 申請日: 2011-08-26
• 公開（公告）號: CN102949715A
• 公開（公告）日: 2013-03-06
• 發明（設計）人: 岳雷;郭鑫;陳靜;李淑芬;韓中山;張振山
• 申請（專利權）人: 唐山怡安生物工程有限公司
• 主分類號: A61K39/12
• 分類號: A61K39/12;C12N7/00;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;張慶敏

技術領域

本發明涉及一種疫苗的制備方法，具體地說，涉及一種利用生物反應器制備豬乙型腦炎滅活疫苗的方法。

背景技術

豬乙型腦炎又稱日本乙型腦炎，是一種由日本乙型腦炎病毒引起的蚊媒性人畜共患病毒性傳染病。主要通過吸血昆蟲(主要為蚊子)叮咬，以豬-蚊-豬循環擴大病毒的傳播，使其成為乙型腦炎病毒的主要增殖宿主和傳染源。各種年齡、品種、性別的豬均易感染此病，患病種豬可垂直傳播傳給仔豬。該病夏秋季節流行，南方6～7月，東北8～9月達到高峰。在我國規模型養豬場中廣泛存在，呈地方性流行，北京、云南、湖南、湖北、福建、廣東、廣西、山西、山東、吉林、甘肅、河北等省份均報道從豬體內或蚊體內分離到乙型腦炎病毒。

豬乙型腦炎無特效治療藥，最主要的防治措施為免疫接種。目前乙腦疫苗主要有三種：日本的鼠腦純化疫苗、中國的SA14-14-2株減毒活疫苗及滅活疫苗。乙腦組織滅活苗雖然安全可靠，但生產成本高，存在大量無關抗原成分，副作用明顯。弱毒疫苗雖然保護性好，但可能出現潛在的毒力返強、帶毒、排毒、垂直傳播等不安全因素，而利用原代地鼠腎細胞生產乙型腦炎滅活疫苗的工藝，很難提高抗原含量和控制疫苗質量，因此，尋找一種安全、有效的乙腦滅活疫苗的生產方法成為亟待解決的問題。

發明內容

本發明旨在克服已有的豬乙腦滅活疫苗制備方法中存在的不足，提供一種新型的、安全、有效的豬乙腦滅活疫苗的制備方法。

為了實現本發明目的，本發明的一種利用生物反應器制備豬乙型腦炎滅活疫苗的方法，其是利用生物反應器和Cytodex-1微載體系統，用乙腦病毒P3株對密度可達1～7×10⁶/ml的乙腦病毒P3株適應的Vero細胞進行病毒感染，培養條件為34±2℃，pH值7～8，待細胞病變達到75％以上時，收獲含有乙腦病毒的培養液，然后對收獲的病毒培養液進行滅活。

其中，乙腦病毒P3株對Vero細胞進行病毒感染的接種比例為0.005～0.5M.O.I。

優選地，使用β-丙內酯滅活病毒，使用量為β-丙內酯∶病毒液(v∶v)＝0.1-2∶4000，更優選地，β-丙內酯∶病毒液(v∶v)＝1∶4000。

前述的方法，其還包括最后向病毒滅活液中加入氫氧化鋁膠和硫柳汞的步驟。優選地，氫氧化鋁膠和硫柳汞的終濃度分別為0.6-1.2mg/ml和0.1mg/ml。

借由上述技術方案，本發明至少具有下列優點及有益效果：

本發明利用生物反應器和Cytodex-1微載體系統，用抗原性好的P3株乙腦病毒，對乙腦病毒P3株適應的高密度Vero細胞進行病毒感染，根據乙腦病毒P3株在Vero細胞上的增殖情況，待細胞病變達一定程度后收獲病毒液，使傳統病毒含量從10^5-6PFU/ml提高到10^7-8PFU/ml以上，病毒含量提高10倍以上。將收獲的病毒液滅活后，加入佐劑定量分裝即可獲得高質量的疫苗成品。制得的疫苗安全、有效，生產工藝穩定，質量可控。另外，與傳統生產工藝相比，本發明改進了培養系統的氧傳遞方式，減少了剪切力，降低有害代謝廢物濃度。由于可模擬空間中的微重力環境，使培養物的重力向量在旋轉過程中產生隨機化，導致一定程度的重力降低，使細胞處于一種模擬自由落體狀態，以此模擬微重力環境。由于沒有攪拌剪切力影響，細胞可以在相對溫和的環境中進行三維生長，同時在動物細胞培養過程中，葡萄糖代謝和谷氨酰胺代謝密切相關。通過控制葡萄糖和谷氨酰胺濃度可控制乳酸和氨等有害代謝物的產生濃度，可有效控制細胞生長狀況。大規模連續灌流培養高密度宿主細胞，細胞密度可達7×10⁶/ml，這種成本低、易于操作的細胞能量代謝轉移研究方法，為實現高密度、高產率的細胞培養優化工藝提供了廣闊的應用前景。

附圖說明

圖1為本發明方法制得的豬乙型腦炎滅活疫苗的動物學免疫實驗結果。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。

以下實施例中使用的非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)購自ATCC，Cytodex-1微載體系統購自Amersham公司，乙腦病毒P3株購自中國藥品生物制品檢定所。

實施例1?乙腦病毒P3株適應的Vero細胞傳代擴增培養

將乙腦病毒M53代P3株乙型腦炎病毒種子用標準MEM培養基稀釋后，腦內接種乳鼠，采集死亡小鼠腦組織，研磨制成腦組織懸液，離心，取上清制成乙型腦炎鼠腦病毒。