[發明專利]水稻金屬離子轉運蛋白及其編碼基因和在重金屬吸收轉運方面的應用

無效

• 申請號: 201110249239.9
• 申請日: 2011-08-26
• 公開（公告）號: CN102276710A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發明（設計）人: 張美;劉寶秀;袁連玉
• 申請（專利權）人: 中國科學院華南植物園
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C12N15/29;C12N15/63;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/865
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星;余炳和

技術領域：

本發明屬于生物基因工程領域，具體涉及水稻金屬離子轉運蛋白及其編碼基因和在重金屬吸收轉運方面的應用。

背景技術：

釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)是發酵生物工程中的常用菌株，在食品及輕工業行業中有較為廣泛的應用。釀酒酵母不僅是白酒、葡萄酒和啤酒等酒飲料的生產過程中必須生產環節(李箏等，優良釀酒酵母菌的發酵性能研究。中國釀造。2008。19：10-12)，更被用作飼料和食品(保健品)添加劑(王鵬銀等，釀酒酵母源飼料添加劑的研究與應用。飼料工業。2011。32(2)：30-35；李沛等，安琪酵母抽提物及其在食品調味品中的應用。中國釀造。2010。215：17-21)。在發酵生物工程中，獲得優質的酵母菌株往往是生產的關鍵環節。傳統的篩選優質酵母菌株的方法主要是通過自然篩選、誘變育種和雜交育種等方法來進行選育(馬福榮等，富鉬釀酒酵母菌株的選育及其生物學功能研究。山東農業科學。2008。6：63-69)，隨著基因工程的發展，人們在利用基因工程改良酵母菌株的研究中也取得了良好的進展，并已逐漸成為基因改良的主流(韓北忠等，葡萄酒釀酒酵母菌基因工程改良。中國釀造。2007。5：1-6)。

隨著工業的發展和人類活動范圍的拓展，重金屬污染已經影響到人類社會生活的方方面面。其中重金屬引發的食品安全問題尤其引起人們的關注。酵母菌株無論是應用于發酵生物工程，還是應用于飼料和食品(保健品)添加，重金屬的含量已成為衡量是否為優質酵母菌株的標準之一。1995年發布的《中華人民共和國輕工行業標準》中對釀酒活性干酵母衛生要求中，限定重金屬含量(以Pb計)應小于20mg/kg。因此，降低釀酒酵母中的重金屬含量也是改良釀酒酵母工程菌株一個重要指標。

發明內容：

本發明的第一個目的是提供一種水稻金屬離子轉運蛋白OsMTP11及其編碼基因OsMTP11。

本發明的水稻金屬離子轉運蛋白OsMTP11，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，其編碼基因OsMTP11的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。應當理解，考慮到密碼子的簡并性，在不改變氨基酸序列的前提下，對上述編碼基因的核苷酸序列進行修改，也屬于本發明的保護范圍內。

本發明的第二個目的是提供一種含有水稻金屬離子轉運蛋白基因OsMTP11的重組表達載體。

所述的表達載體優選為表達載體pYES260(如圖1所示)。

本發明的第三個目的是提供一種含有上述重組表達載體的釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)。

本發明的第四個目的是提供水稻金屬離子轉運蛋白基因OsMTP11在重金屬吸收和轉運方面的應用。

本發明以水稻幼苗葉片為材料，提取其總RNA，再將mRNA反轉錄成cDNA，以該逆轉錄產物為模板設計引物進行PCR擴增，獲得1.3kb的片段。采用瓊脂糖凝膠電泳回收片段，連接于pGEMT載體上，測序分析，該序列包含一個開放閱讀框，為1248個堿基，其序列如SEQ?ID?NO.1所示，將此基因命名為OsMTP11，其編碼蛋白具有415個氨基酸殘基，其序列如SEQ?ID?NO.2所示，將該蛋白命名為OsMTP11。再將OsMTP11基因連入酵母表達載體pYES260中，再用醋酸鋰法將含有OsMTP11基因的表達載體pYES260轉入釀酒酵母菌BY4741中，再在含有0.1mM?Mn，0.2mM?Co，0.2mM?Ni和3mM?Zn的培養基中培養，然后用原子吸收光譜的方法測定釀酒酵母菌中四種重金屬離子的含量，結果發現轉有含有OsMTP11基因的表達載體pYES260的釀酒酵母菌BY4741中的Mn，Co，Ni和Zn四種金屬離子的含量低于野生型釀酒酵母株系，其中的Ni離子含量達到顯著性差異。

將OsMTP11基因編碼的蛋白質在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中采用BlastP程序進行序列比對之后，發現該蛋白與擬南芥中的金屬離子轉運蛋白AtMTP11具有較高的序列同源性，其氨基酸序列一致性達到75.66％。序列分析結果再結合上述實驗結果表明，本發明的OsMTP11基因是水稻金屬離子轉運蛋白基因，其編碼的蛋白是水稻金屬離子轉運蛋白。

因此可以將本發明的OsMTP11基因應用到重金屬吸收和轉運方面中。本發明的OsMTP11基因與表達載體連接，再轉入宿主細胞中，如釀酒酵母中，能降低宿主細胞中的金屬離子含量。