[發(fā)明專利]一種用于細(xì)菌診斷的核苷酸序列及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110243694.8
• 申請(qǐng)日: 2011-08-24
• 公開（公告）號(hào): CN102304573A
• 公開（公告）日: 2012-01-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孟雙;徐建國;葉長蕓
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12Q1/10;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及TaqMan探針在細(xì)菌檢測中的應(yīng)用，特別是在類志賀鄰單胞菌鑒別診斷中的應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)和微生物學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

類志賀鄰單胞菌(Plesiomonas?shigelloides)呈世界性分布。淡水水源和江河水生態(tài)環(huán)境是類志賀鄰單胞菌的主要儲(chǔ)存地，魚類是類志賀鄰單胞菌常見的宿主。過去認(rèn)為該菌對(duì)人的致病性不強(qiáng)，是魚類等水生動(dòng)物重要的致病菌。最近幾年由該菌引起的嬰幼兒、老年人以及免疫功能不全病人的胃腸道感染病例逐漸增加，是人類腸炎的主要病因，世界各地屢有報(bào)道。類志賀鄰單胞菌亦可引起人類菌血癥、蜂窩組織炎、腦膜炎等腸外感染，該菌亦與旅行者腹瀉密切相關(guān)。

類志賀鄰單胞菌是一種革蘭氏陰性、能運(yùn)動(dòng)、兼性厭氧、氧化酶陽性的非孢子繁殖的細(xì)菌，1947年首次從腹瀉病人糞便中分離出來。類志賀鄰單胞菌是鄰單胞菌屬中唯一的一個(gè)種，其分類歸屬地位復(fù)雜。該菌曾與對(duì)人類致病的弧菌屬和氣單胞菌屬一起歸屬于弧菌科，后研究發(fā)現(xiàn)其在分子水平跟類志賀鄰單胞菌和變形桿菌屬更為接近，在2005年第二版《系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)伯杰氏手冊(cè)》中，類志賀鄰單胞菌才被確立為腸桿菌科，鄰單胞菌屬。

作為腸桿菌科病原菌，國內(nèi)外已有過多起關(guān)于該菌引起的感染性腹瀉和食物中毒的報(bào)道，可認(rèn)為是一種新的引起人類腹瀉的重要腸道病原菌。來自日本的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在1994至1996年間所有引起旅行者腹瀉的腸桿菌中，類志賀鄰單胞菌位居第一(66.7％)。

在日常感染性腹瀉病原菌監(jiān)測過程中，對(duì)類志賀鄰單胞菌的檢測較少，在糞便樣本的常規(guī)培養(yǎng)中往往將其忽略，并且該菌缺少特異的篩選培養(yǎng)基，在一些腸道培養(yǎng)基上形成的菌落性狀與嗜水氣單胞相似，難以區(qū)別，這也影響了類志賀鄰單胞菌的分離率。類志賀鄰單胞菌的傳統(tǒng)檢測方法需要進(jìn)行選擇性增菌、多種培養(yǎng)基篩選鑒定，整套操作步驟繁多，耗時(shí)至少6-7天，且檢測結(jié)果容易受到操作人員經(jīng)驗(yàn)豐富與否的影響。通過序列比對(duì)我們發(fā)現(xiàn)類志賀鄰單胞菌的23S?rRNA基因的5′端區(qū)域的核酸序列變異度高，可以將類志賀鄰單胞菌與其他密切相近的菌屬例如變形桿菌屬、弧菌屬以及氣單胞菌屬區(qū)分開來。最近，一些學(xué)者采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法對(duì)該區(qū)域的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增檢測，雖然這種方法可以節(jié)省大量的時(shí)間并使整個(gè)操作變得簡單，但是這種方法在實(shí)際應(yīng)用中存在不可避免的弊端。例如靈敏度低，容易對(duì)含菌量低的標(biāo)本發(fā)生漏檢；還有特異性差，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)含有stx2基因的大腸桿菌在用該方法進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)也會(huì)產(chǎn)生一個(gè)大小類似的擴(kuò)增條帶，影響了類志賀鄰單胞菌的鑒定。因此在本技術(shù)領(lǐng)域需要建立一種針對(duì)類志賀鄰單胞菌的高特異性，特別是能夠鑒別診斷腸出血性大腸桿菌的檢測方法。

最近幾年，實(shí)時(shí)熒光TaqMan?PCR技術(shù)(real?time?TaqMan?PCR，TaqMan是羅氏公司(Roche?Molecular?System，Inc.)的注冊(cè)商標(biāo))廣泛的應(yīng)用于病原體微生物的檢測，普通PCR方法只能將產(chǎn)物從大小上進(jìn)行區(qū)分，實(shí)時(shí)熒光TaqMan?PCR技術(shù)在普通PCR的基礎(chǔ)上又加入一條特異的熒光探針，并且該技術(shù)對(duì)引物與模板的同源性要求也高于普通PCR。實(shí)時(shí)熒光TaqMan?PCR中的探針序列必須與目標(biāo)序列完全匹配，熒光基團(tuán)連接在探針的5′末端，而淬滅劑則在3′末端。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；但在PCR擴(kuò)增時(shí)，隨著引物的延伸Taq酶的5′-3′外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)。即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。因此比普通PCR法具有更高的特異性。但是在熒光TaqMan?PCR技術(shù)的應(yīng)用中，探針的選擇是一個(gè)重要因素，因?yàn)槠渖婕暗脚c引物的匹配，以及最關(guān)鍵的檢測特異性的問題。在本發(fā)明中，我們針對(duì)類志賀鄰單胞菌的23S?rRNA基因的5′端上下游引物之間的保守序列設(shè)計(jì)了一條TaqMan探針，旨在建立一種針對(duì)該病原菌的靈敏、特異、快速的核酸檢測體系。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種應(yīng)用能夠應(yīng)用于細(xì)菌檢測，特別是熒光TaqMan?PCR技術(shù)的檢測探針序列，更進(jìn)一步提供熒光TaqMan?PCR技術(shù)檢測類志賀鄰單胞菌方法，以及用于該方法的試劑盒。