[發(fā)明專利]一種NK和/或NKT細(xì)胞的培養(yǎng)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110235506.7
• 申請(qǐng)日: 2011-08-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102676453A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-09-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬潔;趙晨;趙平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所
• 主分類號(hào): C12N5/0783
• 分類號(hào): C12N5/0783
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種NK和/或NKT細(xì)胞的培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

NK細(xì)胞，是骨髓來(lái)源的淋巴細(xì)胞，可以識(shí)別并殺死病毒感染的細(xì)胞或轉(zhuǎn)化的惡性細(xì)胞。NK細(xì)胞是體內(nèi)快速反應(yīng)細(xì)胞，能迅速被募集至損傷部位，在體外1小時(shí)、體內(nèi)4小時(shí)即可見(jiàn)到殺傷效應(yīng)。NK細(xì)胞的功能是其他免疫細(xì)胞無(wú)法替代的，其殺傷腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)無(wú)MHC限制，因此稱為自然殺傷活性；而且，NK細(xì)胞通過(guò)分泌IFN-gamma以及與DC相互作用促進(jìn)Th1型T細(xì)胞活化。體外培養(yǎng)的NK細(xì)胞包括CD56弱表達(dá)和CD56強(qiáng)表達(dá)伴隨CD16表達(dá)或不表達(dá)細(xì)胞群。CD56強(qiáng)表達(dá)細(xì)胞群通過(guò)非MHC限制途徑殺傷腫瘤細(xì)胞；而CD56弱表達(dá)且CD16+細(xì)胞群則通過(guò)CD16-Fc途徑直接產(chǎn)生ADCC，且腫瘤相關(guān)抗原的刺激能進(jìn)一步促進(jìn)ADCC。鑒于NK細(xì)胞在抗腫瘤免疫中的重要功能，有必要開(kāi)發(fā)一種有效的體外培養(yǎng)并大量擴(kuò)增具有腫瘤殺傷活性的NK細(xì)胞的方法。

現(xiàn)有的NK細(xì)胞體外培養(yǎng)方法盡管已比較成熟，能夠培養(yǎng)出對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷性很高的NK細(xì)胞，但增殖數(shù)量還不夠滿意。IL-2、IL-15和IL-7可以通過(guò)與NK細(xì)胞表面的多聚蛋白體受體的結(jié)合而刺激細(xì)胞活化、增殖。此外，一些研究還發(fā)現(xiàn)這三種細(xì)胞因子與NK細(xì)胞的分化相關(guān)。然而，在培養(yǎng)基中僅添加IL-2、IL-15只能使NK細(xì)胞擴(kuò)增10倍左右，并且通常需要飼養(yǎng)層細(xì)胞共同培養(yǎng)，操作復(fù)雜，細(xì)胞得率低。

RetroNecinn是TAKARA?Bio?Inc的專利產(chǎn)品，屬于重組人纖維連接蛋白片段，它含有人纖維連接蛋白CS-1位點(diǎn)和central?cell-binding?domain，分子量約為63K，其生理活性為參與細(xì)胞的附著、伸展、分化和增殖。RetroNectin的CS-1site及central?cell-binding?domain可與T細(xì)胞表面的VLA結(jié)合，從而刺激細(xì)胞大量繁殖。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種培養(yǎng)NK和/或NKT細(xì)胞的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：

將離體的NK和/或NKT細(xì)胞接種到如下培養(yǎng)體系A(chǔ)中培養(yǎng)，即得到增殖的NK和/或NKT細(xì)胞；

所述培養(yǎng)體系A(chǔ)為如下1)或2)：

1)所示培養(yǎng)體系A(chǔ)由抗CD3抗體、Retronectin、培養(yǎng)基和誘導(dǎo)因子組成；

2)所示培養(yǎng)體系A(chǔ)由抗CD3抗體、培養(yǎng)基和誘導(dǎo)因子組成。

所述抗CD3抗體與所述培養(yǎng)基的配比為5μg∶5ml；

所述Retronectin與所述培養(yǎng)基的配比為25μg∶5ml；

所述誘導(dǎo)因子為IL-2和IL-15；

所述IL-2在所述培養(yǎng)體系A(chǔ)中的濃度為800-1200IU/ml，所述IL-2在所述培養(yǎng)體系A(chǔ)中的濃度具體為1000IU/ml；

所述IL-15在所述培養(yǎng)體系A(chǔ)中的濃度為18ng/ml-22ng/ml，所述IL-15在所述培養(yǎng)體系A(chǔ)中的濃度具體為20ng/ml。

1)所示培養(yǎng)體系A(chǔ)中的所述抗CD3抗體和Retronectin由緩沖液A提供：

每2ml所述緩沖液A按照如下方法制備：將25μg?Retronectin、5μg抗CD3抗體和濃度為0.01M、PH值為7.2的PBS緩沖液混合，用所述PBS緩沖液補(bǔ)至2ml；

2)所示培養(yǎng)體系B中的所述抗CD3抗體由緩沖液B提供：

每2ml所述緩沖液B按照如下方法制備：將25μg?Retronectin和濃度為0.01M、PH值為7.2的PBS緩沖液混合，用所述PBS緩沖液補(bǔ)至2ml；

所述培養(yǎng)時(shí)間為70小時(shí)-74小時(shí)，所述培養(yǎng)時(shí)間具體為72小時(shí)，所述培養(yǎng)溫度為35℃-38℃，所述培養(yǎng)溫度具體為37℃，所述培養(yǎng)所需CO₂的濃度為4.5％-5.5％(體積百分含量)，所述培養(yǎng)所需CO₂的濃度具體為5％(體積百分含量)。

在所述培養(yǎng)步驟后，還包括如下步驟：

將所述培養(yǎng)得到的細(xì)胞移入不含有抗CD3抗體和Retronectin的培養(yǎng)體系B中繼續(xù)培養(yǎng)，得到增殖的NK和/或NKT細(xì)胞；

所述培養(yǎng)體系B和所述培養(yǎng)體系A(chǔ)的區(qū)別為不含有抗CD3抗體和Retronectin，其它組分和各組分濃度均相同。

所述緩沖液A、所述緩沖液B和所述誘導(dǎo)因子均為獨(dú)立包裝。

所述培養(yǎng)基為10％(體積百分含量)離體血漿的T503培養(yǎng)基，即為10％(體積百分含量)自體血漿的T503培養(yǎng)基；

所述抗CD3抗體為單抗或者多抗；